Стабильные изотопы и экология




Скачать 360.22 Kb.
НазваниеСтабильные изотопы и экология
страница2/2
Дата27.09.2012
Размер360.22 Kb.
ТипДокументы
1   2

[13C]Аланин. Включение атома изотопа углерода 13C в молекулу аланина происходило за счет реакции карбоксилирования ацетил-СоА до пирувата. Такой путь биосинтеза был продемонстрирован для других таксономических родов и видов метаногенных бактерий [20].

 

[13C]Серин и [13C]глицин. Характер распределения атомов изотопа углерода 13C в молекулах серина и глицина был объяснён частичным фосфорилированинем пирувата до фосфопирувата и образованием 3-фосфоенолпирувата по гликогенному пути ассимиляции углерода. Подтверждением этому служат значительные уровни активности ферментов- фосфоенолпируватсинтетазы, енолазы и 2-фосфоглицератмутазы, которые были обнаружены в клеточных экстрактах других метаногенов, например, Methanobacterium thermoautotrophicum [21].

 

[13C]Аспарагиновая кислота, [13C]треонин и [13C]метионин. Включение атома изотопа углерода 13C по атому углерода a-карбоксильной группы аспартата, происходящего из C1-ацетата и по b-углеродному атому С2-ацетата и включение атома изотопа углерода 13C в карбоксильные группы аминокислот из диоксида углерода, свидетельствовало о том, что биосинтез аспартата в этой бактерии происходил через цикл трикарбоновых кислот в результате ферментативного карбоксилирования пирувата до оксалоацетата.

 

Распределение атомов изотопа углерода 13C в молекулах треонина и метионина происходило в соответствии с путем биосинтеза этих аминокислот из аспартата. Атом углерода в метильной группе молекулы метионина происходил из диоксида углерода.

 

[13C]Лизин. Распределение атома изотопа углерода 13C в молекуле лизина свидетельствовало о том, что лизин синтезировался из пирувата и аспартата по типичному для бактерий диаминопимелиновому пути [22].

 

[13C]Глутаминовая кислота, [13C]аргинин и [13C]пролин. В молекуле глутаминовой кислоты атомы изотопа углерода  детектировались в Сb и Cy положениях углеродного скелета молекулы. Атомы углерода при карбоксильной СООН- группе молекулы глутаминовой кислоты и в a-положении происходили из диоксида углерода. Этот результат свидетельствовал о том, что цикл трикарбоновых кислот приводил к образованию a-кетоглутарата. Распределение атомов изотопа углерода 13C в молекулах аргинина и пролина аналогично таковому в глутаминовой кислоте.

 

[13C]Лейцин, [13C]валин и [13C]изолейцин. Характер изотопного включения углерода 13C в молекулы лейцина и валина свидетельствовал об их образовании из a-ацетолактата, в то время как биосинтез изолейцина отличался от ожидаемого пути биосинтеза этой аминокислоты из треонина. В клетках M. hungatei изолейцин образовывался из ацетата. Аналогичный путь биосинтеза изолейцина был обнаружен у спирохеты [23], у лейцинассимилирующего мутанта Serratia marcescens [24], и у мутанта Saccharomyces cerevisiae, у которого дефектен ген треониндезаминазы [25].

 

[13C]Фенилаланин и [13C]тирозин. Меченые позиции атома углерода в молекулах фенилаланина и тирозина полностью совпадали с типичным для бактерий путем биосинтеза этих аминокислот из шикимовой и хоризмовой кислот [26].

 

[13C]Гистидин. Атом углерода в положении Cg имидазольного кольца гистидина происходил из диоксида углерода. Углеродный атом в положении Сe имидазольного кольца гистидина был замещён на изотоп углерода 13C с участием С2- ацетата.

 

Другими перспективными источниками изотопномеченых аминокислот и белков признаны метилотрофные микроорганизмы, способные ассимилировать метанол и C1-углеродные соединения по рибулозофосфатному и сериновому циклам ассимиляции углерода. Метилотрофы представленны в таксономическом аспекте грамположительными, грамотрицательными бактериями и дрожжами, интерес к которым в настоящее время все возрастает благодаря разработке новых технологий химического синтеза метанола. Эти бактерии привлекают внимание исследователей прежде всего как дешевые источники микробного белка и аминокислот. Знание путей бактериального метаболизма позволяет осуществлять направленное введение атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот.

 

Метилотрофные бактерии окисляют метанол с использованием фермента - метанолдегидрогеназы, последующие окислительные реакции катализируют формальдегид- и формиатдегидрогеназа [27]. Лишь затем продукт окисления метанола в виде формальдегида фиксируется клеткой одним из двух путей ассимиляции углерода: рибулозо-5-монофосфатным и сериновым [28].

 


Табл. 1

Параметры роста некоторых используемых в биотехнологии штаммов метилотрофных бактерий


Штаммы бактерий

Молярный выход биомассы, г/моль метанола

Удельная скорость роста, ч-1

Эффективность конверсии углерода метанола, %

Количество потребленного азота, %Рибулозо-5-монофосфатный путь ассимиляции углеродаPseudomonas C117,30,4967,513,2Pseudomonas methanolica17,00,6366,511,0Methylomonas methanolica15,70,5262,011,7Сериновый путь ассимиляции углеродаPseudomonas 112,10,17647,511,37Pseudomonas 13512,10,1447,511,37Pseudomonas AM19,80,09337,611,20Pseudomonas M2713,10,10851,09,40Pseudomonas roseus13,10,1551,010,60

Мы начали эффективно использовать ауксотрофные штаммы метилотрофных бактерий для включения атомов стабильных изотопов дейтерия 2H и углерода 13C в молекулы аминокислот ещё 10 лет тому назад, работая в группе академика РАМН В.И. Швеца на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова. Для этих целей мы использовали биологическую конверсию дешёвых низкомолекулярных меченых субстратов - (13C)метанола, (2Н)метанола и тяжёлой воды 2H2O в клетках метилотрофов в молекулы дорогостоящих меченых БАС [29-38]. Традиционным подходом при этом было выращивание соответствующих штаммов-продуцентов аминокислот, устойчивых к росту на средах, содержащих стабильные изотопы водорода, углерода, азота и др.


Наши исследования показали, что [13C]метанол в отличие от тяжёлой воды не оказывает существенного биостатического эффекта на ростовые и биосинтетические характеристики метилотрофов, поэтому данный подход можно эффективно использовать для введения в молекулы синтезируемых БАС двойной изотопной метки (например, введение изотопа углерода 13C в молекулы на фоне максимальных концентраций тяжёлой воды в ростовых средах). Hами были получены [2H]- и [13C]аминокислоты с разными уровнями изотопной обогащённости при росте ауксотрофного по L-лейцину штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum и ауксотрофного по L-изолейцину штамма облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillus flagellatum на минимальных средах с (13C)метанолом, (2Н)метанолом и тяжёлой водой 2H2O . [13C]- и [2Н]аминокислоты разного уровня изотопной замещённости выделяли как из культуральных жидкостей, полученных после выращивания бактерий на средах с соответствующими изотопномечеными субстратами, так из гидролизатов белков биомассы.

 

Биосинтетически полученные нами молекулы [2H]- и [13С]аминокислот представляли собой смеси, в которых присутствовали изотопно-замещённые формы молекул, различающиеся количеством атомов водорода и углерода, замещённых на дейтерий 2H и изотоп углерода 13C. При этом распределение зависело как от общего включения изотопа в молекулу, так и от способа их получения. Наши исследования показали, что в условиях ауксотрофности по лейцину уровень изотопного обогащения молекулы лейцина, а также метаболически связанных с ним молекул аминокислот немного ниже, чем для других молекул аминокислот, вероятно, за счёт сохранения минорных путей метаболизма, связанных с биосинтезом данных аминокислот de novo. При выращивании B. methylicum на среде, содержащей 98% тяжёлую воду 2H2O и немеченый L-лейцин, уровни включения дейтерия в молекулы индивидуальных аминокислот культуральной жидкости составил 51% для молекулы лейцина/изолейцина, 58,8% для молекулы валина, в то время как уровни изотопного включения для молекулы аланина составили 77,5%, а для молекулы фенилаланина -75%.

 

Аналогичная корреляция наблюдается и в молекулах аминокислот белковых гидролизатов. Уровни включения атомов дейтерия 2H и углерода 13C в молекулы метаболически связанных аминокислот в пределах одинаковых концентраций меченых субстратов, обнаружили определённую коррелляцию: уровни изотопного включения для молекул валина и лейцина (семейство пирувата), фенилаланина и тирозина (семейство ароматических аминокислот) коррелировали. Уровни изотопного включения для молекул глицина и серина (семейство серина), аспарагиновой кислоты и лизина (семейство аспарагина) также имели близкие величины. Важным результатом являются высокие уровни включения атомов стабильных изотопов 2Н и 13C в молекулы полученных аминокислот.


Табл. 2

Суммарные уровни включения стабильных изотопов в молекулы секретируемых аминокислот и аминокислотные остатки суммарных белков биомассы B. methylicum* и M. flagellatum**.


Аминокислоты

Концентрация 2Н2О в ростовой среде, об%

24,5 49,0 73,5 98,0

КЖ# белок КЖ белок КЖ белок КЖ белок

1 %13СН3ОН

КЖ белокГлицин- 15,0- 35,0- 50,0- 90,060,0 90,0Aланин24,0 20,037,5 45,062,5 62,577,5 97,535,0 95,0Валин20,0 15,046,3 36,343,8 50,058,8 50,050,0 50,0Лейцин/изолейцин15,0 10,047,0 42,046,0 45,051,0 49,038,0 49,0фенилаланин15,0 24,527,5 37,551,2 50,075,0 95,095,0 80,5Tирозин- 20,0- 25,6- 68,8- 92,8- 53,5Серин- 15,0- 36,7- 47,6- 86,6- 73,3Aспарагиновая кислота- 20,0- 36,7- 60,0- 66,6- 33,3Глутаминовая кислота- 20,0- 40,0- 53,4- 70,0- 40,0Лизин- 10,0- 35,3- 40,0- 58,9- 54,4

*Данные по включению дейтерия в молекулы аминокислот приведены для B. methylicum при росте на средах, содержащих 2% CH3OH и 24,5; 49,0; 73,5; 98,0% 2Н2О

**Данные по включению 13С приведены для M. flagellatum при росте на среде, содержащей обычную воду и 1% 13СН3ОН.

#Термином КЖ обозначены культуральные жидкости, полученные после отделения клеток из ростовых сред


Также нами была изучена адаптация этих бактерий к тяжёлой воде на предмет получения клеточных БАС. Показано, что способность к адаптации к тяжёлой воде у разных родов и видов бактерий различная и может варьировать на примере метилотрофных бактерий в пределах даже одной таксономической группы. Адаптация к тяжёлой воде определяется как таксономической специфичностью микрооорганизмов, так и особенностями их метаболизма, функционированием различных путей ассимиляции субстратов, а также эволюционной нисшей, которую занимает исследуемый объект. Полученные данные подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация к тяжёлой воде является фенотипическим явлением, поскольку адаптированные к тяжелой воде клетки возвращаются к нормальному росту и биосинтезу в протонированных средах после некоторого лаг-периода. По-видимому, клетка реализует лабильные адаптивные механизмы, которые способствуют функциональной реорганизации работы жизненно-важных систем в тяжёлой воде. Так, например, нормальному биосинтезу и функционированию в тяжёлой воде таких биологически активных соединений, как нуклеиновые кислоты и белки способствует поддержание их структуры посредством формирования водородных (дейтериевых) связей в молекулах. Связи, сформированные атомами дейтерия различаются по прочности и энергии от аналогичных водородных связей. Различия в нуклеарной массе атома водорода и дейтерия косвенно могут служить причиной различий в синтезах нуклеиновых кислот, которые могут приводить в свою очередь к структурным различиям и, следовательно, к функциональным изменениям в клетке.


Ферментативные функции и структура синтезируемых белков также изменяются при росте клеток на тяжёлой воде, что может отразиться на процессах метаболизма и деления клетки. После обратного изотопного (1Н-2H)-обмена ферменты не прекращают своей функции, но изменения в результате изотопного замещения за счет первичного и вторичного изотопных эффектов, а также действие тяжёлой воды как растворителя (большая структурированность и вязкость по сравнению с обычной водой) приводили к изменению скоростей и специфичности ферментативных реакций в тяжёлой воде.


Структурно-динамические свойства клеточной мембраны, которые в большинстве зависят от качественного и количественного состава липидов, также изменяются в присутствии тяжёлой воды. Полученный результат объясняется тем, что клеточная мембрана является одной из первых органелл клетки, которая испытывает воздействие тяжёлой воды, и тем самым компенсирует реалогические параметры мембраны (вязкость, текучесть, структурированность) изменением количественного состава липидов.


В общих чертах, при попадании клетки в дейтерированную среду из неё не только исчезает протонированная вода за счет реакции обмена вода-тяжёлая вода, но и происходит очень быстрый изотопный (1Н-2H)-обмен в гидроксильных, карбоксильных, сульфгидрильных и аминогруппах всех органических соединений, включая нуклеиновые кислоты, липиды, белки и сахара. Известно, что в этих условиях только С-Н связь не подвергается изотопному обмену и вследствие этого только соединения со связями типа С-2H могут синтезироваться de novo.


Кроме вышеобозначенных эффектов, возможное изменение соотношения основных метаболитов в процессе адаптации к тяжелой воде также может негативно сказываться на рост клетки. Возможно, что эффекты, наблюдаемые при адаптации к тяжёлой воде связаны с образованием в тяжёлой воде конформаций молекул с иными структурно-динамическими свойствами, чем конформаций, образованных с участием водорода, и поэтому имеющих другую активность и биологические свойства. Так, по теории абсолютных скоростей разрыв С1H-связей может происходить быстрее, чем С2H-связей, подвижность иона 2H+ меньше, чем подвижность 1Н+, константа ионизации тяжёлой воды несколько меньше константы ионизации обычной воды.


Суммируя полученные данные, был сделан вывод, что чувствительности различных клеточных систем к тяжёлой воде отличны. С точки зрения физиологии, наиболее чувствительными к замене 1Н+ на 2H+ могут оказаться аппарат биосинтеза макромолекул и дыхательная цепь, т. е., именно те клеточные системы, которые используют высокую подвижность протонов и высокую скорость разрыва водородных связей. В настоящее время исследования по изучению биотехнологического потенциала метилотрофных бактерий для направленного синтеза изотопномеченых аминокислот и других БАС ведутся на кафедре биотехнологии МГАТХТ им. М.В. Ломоносова и в ГНИИ Генетики и селекции промышленных штаммов микроорганизмов.


 

Генно-инженерные методы включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот и белков.

 

Осуществлять направленное биосинтетическое включение атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот и белков удобно за счёт использования векторов экспрессии нужных генов, ответственных за биосинтез того или иного интересующего исследователей белка. Оправдано и целесообразно использование для этих целей векторов экспрессии на основе плазмидной ДНК бактерии E. coli, например, вектор экспрессии Т4 лизоцима, включающий в своем составе плазмиду pHSe5 [39]. В результате использования этого вектора экспрессии, были получены миллиграммовые количества Т4-лизоцима, селективно меченного стабильными изотопами азота-15N и углерода 13C. Включение атомов стабильных изотопов в молекулы достигалось за счет роста генного конструкта E. coli на средах, содержащих [15N]- или [13C]аминокислоты. Метод также может применяться для получения индивидуальных меченых белков, экспрессия которых происходит в системах, отличных от E. coli, например, системы экспрессии на основе клеток насекомых или млекопитающих.

 

Другие микробные системы, в которых белки экспрессируются с высокими выходами, также могут быть пригодны для включения атомов стабильных изотопов в молекулы. К ним относятся такие хорошо изученные биологические объекты, как дрожжи, бактерии и бактериофаги. Так, за счёт использования вышеперечисленных микробных объектов в качестве векторов экспрессии были получены препаративные количества индивидуальных очищенных [15N]белков: нуклеаза стафилококка [40], интерлейкин 1b [41], белок репрессор фага P22C2 [42], тиредоксин E. coli [43], гемоглобин [44], a-протеаза [45], ингибитор субтилизина [46], репрессор фага лямбда [47], и белок человеческого фактора роста N-ras P21 [48].

 

Ведущим научным сотрудником ГосНии ГЕНЕТИКА Д. А. Складневым разработан метод включения атомов дейтерия в молекулы индивидуальных белков на основе вектора экспрессии на основе штамма облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillus flagellatum [49]. Метод состоит в том, что в метилотрофах клонируют структурный ген исследуемого белка. Таким методом можно в будущем получать, например, [2H]b-интерфероны, хорошо экспрессируемые в клетках метилотрофов, либо другие интересующие исследователей белки. Метод также позволяет вводить в молекулы аминокислот и белков другие атомы стабильных изотопов, например, изотоп углерода 13C. Однако основным недостатком при использовании полученных данным методом [13C]аминокислот в ЯМР-исследованиях являются недостаточно высокие уровни изотопного обогащения аминокислот, что обусловливает усложнение спектров ЯМР за счет 12C- 13C-спин-спинового взаимодействия между близлежащими атомами углерода в молекуле. Так как мультиквантовые резонансы близлежащих атомов углерода в молекуле являются основным препятствием для интерпретации спектров ЯМР, необходимо применять усовершенствованные методы включения атома изотопа углерода 13C в молекулы аминокислот, позволяющие лимитировать процесс разбавления изотопной метки. Так, в последнее время были генетически сконструированы новые штаммы бактерий, которые несут мутации по генам метаболизма определенного круга предшественников этих аминокислот. Это позволяет избежать разбавления изотопной метки при росте микроорганизма на среде, содержащей те или иные меченые субстраты за счет ингибирования биосинтеза аминокислот de novo у данных мутантных штаммов бактерий.

 

При выборе определенных мутаций по генам метаболизма стремятся удовлетворить как миниум двум условиям для нормального функционирования подобных генетически сконструированных систем, чтобы, во-первых, по возможности снизить деградацию изотопной метки или ее разбавление в процессе внутриклеточного синтеза немеченых предшественников de novo и во-вторых, свести к минимуму процессы перестройки меченых положений углеродного скелета молекулы за счет биосинтеза одинаковых интермедиантов, образующихся по сопряжённым путям биосинтеза. Данная стратегия реализована на примере получения двух генетически сконструированных штаммов бактерий, обозначенных как E. coli DL10 и E. coli DL11, которые несли геномные делеции, исключающие обмен атомов углерода между интермедиаторами в процессе гликолиза и в цикле трикарбоновых кислот [50].

 

За счёт использования генетически сконструированных штаммов удалось включить атомы изотопа углерода 13C в молекулы аминокислот с уровнями изотопного обогащения до 95%. Ферменты у штамма E. coli DL10 были инактивированы за счёт мутаций, вследствие чего он ассимилировал в качестве источников углерода и энергии сукцинат и ацетат из ростовой среды, а [1-13C]лактат добавляли в ростовую среду для компенсации метаболических потребностей клетки и для введения атомов изотопа углерода 13C в молекулы аминокислот, синтезируемых в процессе гликолиза.

 

Другой штамм бактерий E. coli DL11 мог утилизировать немеченую глюкозу в качестве источников углерода и энергии по гликолитическому пути ассимиляции углерода, в то время как [1,4-13C]cукцинат и [1-13C]ацетат добавляли в ростовую среду для того, чтобы стимулировать биосинтез [13C]аминокислот, образующихся по циклу трикарбоновых кислот. Кроме того, в этом случае было необходимо ввести в бактериальный геном дополнительную мутацию, связанную c геном a-кетоглутаратдегидрогеназы, чтобы минимизировать процесс деградации метки в цикле трикарбоновых кислот.

 


Выделение изотопно-меченых молекул аминокислот из белковых гидролизатов микроорганизмов.

 

 

Биомасса микроорганизмов, выращенных на средах, содержащих стабильные изотопы, является ценным источником различных изотопно-меченых БАС, в том числе аминокислот. При этом наиболее распространённым и традиционным методом препаративного выделения аминокислот из клеточной биомассы является её гидролиз с использованием ферментативных или химических методов и последующая ионообменная хроматография на катионо- и анионообменных смолах (дауэкс, амберлит, пермутит, аминекс, дуолит и др.) [51].

 

Большое значение при проведении гидролиза белка имеет выбор того или иного гидролизирующего агента, который определяется целью исследования. Ферментативное расщепление протеолитическими ферментами может протекать ступенчато с концов молекулы (экзопептидазами) или путём расщепления специфических отдельных пептидных связей полипептидной цепи (эндопептидазами), причём специфичность зависит от конфигурации, аминокислотной последовательности и конформации белка. Для селективного химического расщепления белков разработано очень много методов, среди которых имеется несколько методов расщепления по a-углеродному атому (например, через остатки дегидроаланина).

 

Щёлочи и кислоты обладают высокой гидролизующей способностью и поэтому их использование приводит к разрушению некоторых аминокислот и к изотопному обмену в триптофане, тирозине и гистидине и в некоторых других аминокислотах. В условиях щелочного гидролиза (4 н. Ba(OH)2 или NaOH, 24 ч, 110 оС ) реакций изотопного обмена водорода на дейтерий практически не наблюдается (исключением является протон (дейтерон) у атома С2’ гистидина). Существенным недостатком щелочного гидролиза, лимитирующим его использование, является значительная рацемизация аминокислот. Поэтому для препаративных целей щелочной гидролиз используется крайне редко, в то время как кислотный - очень широко.

 

Кислотный гидролиз в стандартных условиях (6 н. НCl или 8 н. Н2SO4 , 24 ч, 110 оС ) приводит к полному разрушению триптофана и частичному разрушению серина, треонина и некоторых других аминокислот. Добавление в реакционную среду фенола, тиогликолевой кислоты, b-меркаптоэтанола, позволяет сохранить до 80-85% триптофана. Кроме этого, в условиях кислотного гидролиза с высокой скоростью протекает изотопный обмен ароматических протонов (дейтеронов) в молекулах триптофана, тирозина и гистидина, а также протонов (дейтеронов) при атоме С3 аспарагиновой и С4 глутаминовой кислот. Поэтому для получения реальных данных о биосинтетическом включении дейтерия в белок рекомендуется проводить кислотный гидролиз в присутствии дейтерированных реагентов. Этим способом могут быть выделены и анализированы с использованием ионообменной хроматографии большинство молекул аминокислот в составе гидролизатов белка.


Метод выделения молекул аминокислот из гидролизатов биомассы, будучи широко применяем на практике часто требует использования вредных буферных растворов (ацетат, формиат, пиридин и др.), нескольких колонок с последующей рехроматографией для полного выделения чистых аминокислот из гидролизатов биомассы.

 

Большой практический интерес представляет реализация преимуществ препаративной обращенно-фазовой высокоэфективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) при разделении оптически чистых изотопно-меченых молекул аминокислот и их N-производных в количествах, необходимых для биоаналитических и синтетических целей. Научным сотрудником МГАТХТ им. М.В. Ломоносова Егоровой Т. А. разработан метод препаративного разделения индивидуальных молекул аминокислот из различных микробиологических источников с помощью ОФ ВЭЖХ в виде бензилоксикарбонильных производных (N-Cbz производных) аминокислот [52]. Этот метод позволяет выделять аминокислоты с высоким выходом (от 67% до 89%) и хроматографической чистотой (96-99%) и может быть использован для выделения [2H]-, [13C]-, [15N] и [18O]аминокислот из белковых гидролизатов различных источников.

 


ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ МЕТОД ВКЛЮЧЕНИЯ АТОМОВ СТАБИЛЬНЫХ ИЗОТОПОВ В МОЛЕКУЛЫ.

 

Другим альтернативным подходом по включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот является химико-ферментативный метод, основанный на комбинации синтетических и ферментативных реакций. Для этого перспективно и экономически оправдано использование препаратов очищенных ферментов и их экстрактов, безклеточных ферментативных систем, а также иммобилизованных ферментов.

 

Ферментативные реакции осуществляют на иммобилизованных ферментах, например, таких как аланиндегидрогеназе (КФ 1.4.1.1) в присутствии NADH при получении [2H]аланина [53], иммобилизованной на сахарозе фенилаланинаммонийлиазе (КФ 4.3.1.5) и фенилаланингидроксилазе (КФ 1.14.16.1), при получении [2H]фенилаланина [54] и [2H]тирозина [55], триптофансинтазе (КФ 4.2.1.20), при получении [2H]триптофана [56], глутаматдегидрогеназе (КФ 1.4.1.2), при получении [2H]глутаминовой кислоты [57], аспартазы (КФ 4.3.1.1), при получении [2Н]аспарагиновой кислоты [58] и серингидроксиметилазе (КФ 2.5.1.6) при получении [2H]серина [59].

 

Ферментативный метод используется для препаративного лабораторного и промышленного получения оптически активных аминокислот, благодаря высокой субстратной специфичности ферментов и возможности селективного введения стабильных изотопов по определённым положениям молекул аминокислот. Основными аспектами использования ферментативных систем являются каталитические реакции ассиметрического образования связи на прохиральных субстратах и ферментативное разделение рацематов аминокислот.

 

Что касается хроматографического разделения рацематов на прохиральных сорбентах, то оно все же недостаточно эффективно для разделения и обеспечивает в лучшем случае больше половины меченого продукта в виде одного из оптических антиподов. Ферментативная стадия часто завершает химический синтез изотопномеченых аналогов аминокислот, причем использование для этих целей интактных клеток или их экстрактов так же эффективно, как использование очищенных ферментов. Однако, субстратная специфичность ферментов, их ограниченная доступность, сложность их выделения и очистки ограничивают их применение для этих целей. Несмотря на то, что ферментативные синтезы преодолевают все вышеперечисленные проблемы, низкие выхода очищенных ферментов лимитируют использование химико-ферментативных реакций. С другой стороны, методы генной инженерии открывают возможности для получения большинства ферментных препаратов в препаративных количествах.

 

Включение изотопа азота 15N в молекулы аминокислот связано с использованием [15N]аммонийных или [15N]нитратных солей в качестве источников изотопной 15N-метки, в то время как ферментативный метод более эффективен для включения изотопа азота 15N в молекулы [15N]аспарагиновой и [15N]глутаминовой кислот за счёт аминирования a-кетопроизводных аминокислот и в тех случаях, когда необходимы высокие уровни включения изотопа 15N в молекулы.

 

Осуществление различных методов включения атомов изотопа азота 15N в молекулы аминокислот связано с использованием методов газовой подпитки 153 [60], иммобилизацией клеток с последующей активацией носителя 154Cl [61], или с оптимизацией концентраций [15N]предшественников аминокислот в ростовых средах.

 

Для включения атомов изотопа углерода 13С в молекулы аминокислот могут применяться аналогичные ферментативные подходы с применением [13С]глюкозы, однако при проведении ферментативной реакции требуются значительные количества высокообогащённой [13С]глюкозы и поэтому данный метод является слишком дорогим для получения [13С]аминокислот. Кроме того, большая часть глюкозы (до 70%) идёт на обеспечение процесса дыхания клетки, поэтому эффективность мечения молекул БАС изотопом углерода за счёт ферментативного окисления [13С]глюкозы невысокая.

 

Перспективны также подходы с использованием комбинации химико-ферментативных и биотехнологических способов включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот.

 

Несмотря на многочисленность описанных в современной литературе подходов по включению атомов стабильных изотопов в молекулы БАС, в настоящее время практически не существует способов, которые позволяют получать аминокислоты и белки, меченные 2Н, 13С, 15N и 18O за счет того или иного универсального подхода, хотя химико-ферментативные методы позволяют использовать одну и ту же химико-биохимическую реакцию для получения меченых аминокислот за счет применения различных меченых низкомолекулярных реагентов (субстратов). Включение атомов стабильных изотопов в молекулы удобнее всего проводить с использованием биотехнологических подходов, в то время как селективности включения стабильных изотопов в молекулы БАС можно достичь за счёт применения комбинации синтетических и ферментативных реакций. Выбор метода получения молекул БАС, несущих тот или иной атом изотопа, определяется прежде всего целью исследования.

 

ЛИТЕРАТУРА.

 

1. Jones W. C., Rothgeb T. M., Gurd F. R. N. // J. Biol. Chem. - 1976. - V. 251.- P. 7452-7460.

 

2. Sternlicht H., Kenyon G. L., Packer E. L., Sinclair J. // J. Am. Chem. Soc. - 1971. - V. 93. - P. 199-208.

 

3. Giza Y. H., Ressler C. // J. Labelled Compd. - 1969. - V. 5. - P. 142-151.

 

4. Havranek M., Kopecka-Schadtova H., Veres K. // J. Labelled Compd. - 1970. - V. 6. - P. 345-354.

 

5. Мосин О. В., Егорова Т. А., Чеботаев Д. А., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. - 1996. - N 4. - С. 27-34.


6. Золотарёв Ю. А., Зайцев Д. А., Татур В. Д., Мясоедов Н. Ф. Способ получения равномерно меченных дейтерием оптически активных a-аминокислот: А. с. N 1685903 СССР. - // ВНИИГПЭ. - 1991. - N 39. - С. 92.


7. Samuel D. Methology of oxygen isotopes. Oxygenases. // Ed. M. Hayaishi. - Academic Press. - New York, 1972. - P. 31-86.

 

8. Oh B. H., Westler W. M., Darba P., Markley J. L. // Science. - 1988. - V. 240. - P. 908-911.

 

9. Stockman B. J., Reily M. D., Westler W. M., Ulrich E. L., Markley J. L. // Biochemistry. - 1989. - V. 28. - P. 230-236.

 

10. Yu L. P., Smith G. M. // Biochemistry. - 1988. - V. 27. - P. 1949-1956.

 

11. Stockman B. J., Westler W. M., Mooberry E. S., Markley J. L. // Biochemistry. - 1988. - V. 27. - P. 136-142.


12. Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. // Биотехнология. - 1993. - N 9. - С. 16-20.

 

13. Daboll H. F., Crespi H. L., Katz J. J. // Biotechnology and Bioengineering. - 1962. - V. 4. - P. 281-297.

 

14. Crespi H. L. Biosynthesis and uses of per-deuterated proteins. Synt. and Appl. of Isot. Label. Compd. // Ed. R. R. Muccino. - Elsevier. - Amsterdam, 1986 - P. 111-112.

15. Randall M., Kathleen S. M., Stanley J. O. // Biochim. Biophys Acta. - 1977. - V. 497. - P. 1-5.

 

16. Beeney J., Birdsall B., Oster G., Carr M. D., Karine M. A. // FEBS Lett. - 1990. - V. 272. - ¹ 1. - P. 197-199.

 

17. Umbarger H. E. // Ann. Rev. Biochem. - 1978. - V. 47. - P. 533-606.

 

18. Bachmann, B. J. // Microbiol. Rev. - 1983. - V. 47. - P. 180-230.


19. Patel G. B., Roth L. A. // Can. J. Microbiol. - 1978. - V. 24. - P. 1007-1010.


20. Fuchs G., Stupperich E. // Arch. Microbiol. - 1980. - V. 127. - P. 267-272.

 

21. Jansen K., Stupperich E., Fuchs G. // Arch. Microbiol. - 1980. - V. 132. - P. 355-364.

 

22. Bender D. A. Amino Acid Metabolism. // 2nd edn. - New York. - John Wiley & Sons, 1985. - P. 34-52.

 

23. Charon N. W., Johnson R. C., Peterson D. // J. Bacteriol. - 1974. - V. 117. - P. 203-211.

 

24. Kisumi M., Komatsubara S., Chibata I. // J. Biochem. - 1977. - V. 82. - P. 95-103.

 

25. Vollbrecht D. // Biochim. Biophys. Acta. - 1974. - V. 362. - P. 382-389.

 

26. Conn E. E. // The Shikimic Acid Pathway. Recent Advances in Phytochemistry. - Plenum Press. - New York, 1986. - V. 20. - P. 34-40.


27. Anthony C. Bacterial oxidation of methane and methanol. Advances in Microbial Physiology. // Eds. Rose A. H., Tempest D. W. - Academic Press. - New York, 1986. - V. 27. - P. 113-203.

 

28. Colby J., Dalton H., Whittenbury R. // Ann. Rev. Microbiol. - 1979. - V. 33. - P. 481-517.


29. Mosin O. V., Karnaukhova E. N., Skladnev D. A. // Application of methylotrophic bacteria for preparation of stable isotope labelled amino acids. Proc. 7th Int. Symp. Genetics of Industrial Microorganisms. - Quebec. Canada. - 26 June 1994. - P. 163.

 

30. Mosin O. V., Karnaukhova E. N., Skladnev D. A. // Preparation of 2H- and 13C-amino acids via bioconvertion of C1-substrates. Proc 8th Int. Symp. Microb. Growth on C1-Compounds. - San Diego. U.S.A. - 27 August 1995. - P. 80.

 

31. Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Складнев Д. А., Акимова О. Л., Цыганков Д. Ю. Штамм Brevibacterium methylicum - продуцент униформно меченой дейтерием аминокислоты - L-фенилаланина. Заявка РФ N 93055824. // ВНИИГПЭ. - 1993. - N 94. - С. 3-4.

 

32. Karnaukhova E. N., Mosin O. V., Reshetova O. S. // Amino Acids. - 1993. - V. 5. - P. 125.

 

33. Складнев Д. А., Мосин О. В., Егорова Т. А., Ерёмин С. В., Швец В. И. // Биотехнология. - 1996. - N 5. - С. 14-20.

 

35. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. - 1996. - N 3. - С. 3-12.


36. Мосин О. В., Егорова Т. А., Складнев Д. А., Швец B. И. // Биоорганическая химия. - 1996. - Т. 22. - N 10-11. - С. 861-874.

 

37. Мосин О. В. Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н (D) и 13С, с высокими степенями изотопного обогащения. Автореф. дис. канд. хим. наук. М.: МИТХТ им. М. В. Ломоносова. - 1996. - С. 3-23.

 

38. Мосин О. В., Егорова Т. А., Чеботаев Д. А., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. - 1996. - N 4. - С. 27-34.


39. Muchmore D. C., McIntosh L. P., Russel C. B., Anderson E. E., Dahlquist F. W. // Meth. Enzymol. - 1990. - V. 77. - P. 346-354.

40. Torchia D. A., Sparks S. W., Bax A. // Biochemistry. - 1989. - V. 28. - P. 5509-5524.

 

41. Marion D., Kay L. E., Sparks S. W., Torchia D. A., Bax A. // J. Am. Chem. Soc. - 1989. - V. 3. - P. 1515-1517.

 

42. Senn H., Euguster A., Otting G., Suter F., Wuthrich K. // Eur. Biophys. J. - 1987. - V. 14. - P. 301-313.

 

43. LeMaster D. M., Richards F. M. // Biochemistry. - 1985. - V. 24. - P. 7263-7268.

 

44. Lapidot, A., Irving, C. S. // J. Am. Chem. Soc. - 1977. - V. 99. - P. 5488-5493.

 

45. Bachovchin W. M., Roberts J. D. // J. Am. Chem. Soc. - 1978. - V. 100. - P. 8041-8046.

 

46. Kainosho M., Tsuji T. // Biochemistry. - 1982. - V. 21. - P. 6273-6279.

 

47. Leighton P., Lu P // Biochemistry. - 1987. - V. 26. - P. 7262-7271.

 

48. Campbell B. S., Papastavros M. Z., McCormick F., Redfield A. G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1989. - V. 86. - P. 817-820.


49. Skladnev D. A., Tsygankov Y. D. // Conversion of stable isotope labeled methanol to components of bacterial biomass. Proc. 6 th Eur. Conf. on Biomass for Energy. - Athens. - Greece. - 22-26 April. - 1991. - P. 234.


50. LeMaster D. M., Cronan J. E. // J. of Biological Chemistry. - 1982. - V. 257. - N 3. - P. 1224-1230.

51. Ниедервайзер А., Патаки Д. Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков. - М.:Мир, 1974. - С. 20-73.

 

52. Егорова Т. А., Еремин С.В , Мосин О. В., Мицнер Б.И, Звонкова Е.. Н., Швец В.И. Биотехнология. - 1993. - N 5. - С. 32-36.


53. Prescan E., Ivanof A., Mocanu A., Palibroda N., Bologa M., Gorun V., Barzu O. // Microbiol. Technol. - 1987. - V. 9. - P. 663-665.

 

54. Hadener A., Tamm C. // J. Labelled Compounds and Radiopharm. - 1987. - V. 24. - P. 1291-1306.

 

55. Walker T. E., Matheny C. // J. Org. Chem. - 1986. - V. 51. - P. 1175-1179.

 

56. Fuganti C., Ghiringhelli D., Giangrasso D., Grasselli P. // J. Chem. Soc. Comm. - 1974. - P. 726-730.

 

57. Сappon J. J., Baart J., van der Walle G. A. M., Raap J., Lugtenburg J. // Recl. Trav. Chim. Pays-Bas. - 1991. - V. 110. - P. 158-166.

 

58. Field S. J., Young D. W. // J. Chem. Soc. Chem. Communs. - 1979. - P. 1163-1165.

 

59. Jordan P. H., Akhtar H. // J. Biochem. - 1970. - V. 116. - P. 277-286.


60. Nabe K., Ujimaru T., Izuo N., Yamada S., Chibata I. // Appl. Environ. Microbiol. - 1980. - V. 40. - P. 19-24.

 

61. Chibata I., Tosa T., Sato T. Microbial technology. // Ed. H. J. Peppler. - 2nd ed. Academic Press, 1979. - V. 11. - P. 433-461.


1   2

Похожие:

Стабильные изотопы и экология iconИзотопы
Задачи: Повторить и обобщить понятия «химический элемент», распространенность химических элементов в земной коре, закрепить понятия...
Стабильные изотопы и экология iconПрограмма для поступающих в магистратуру по специальности
Получили развитие глобальная экология, экология человека, экология города, инженерная экология, медицинская экология, сельскохозяйственная...
Стабильные изотопы и экология iconТематическое планирование по химии в 11 классе
Ядро и электронная оболочка. Электроны, протоны и нейтроны. Микромир и макромир. Дуализм частиц микромира. Химический элемент, изотопы,...
Стабильные изотопы и экология iconУчебно-методический комплекс по дисциплине экология микроорганизмов (название)
Учебная программа по дисциплине «Экология микроорганизмов» составлена в соответствии с требованиями государственного стандарта России....
Стабильные изотопы и экология iconБиблиографический указатель книг, поступивших в библиотеку в декабре 2011 Г
Александровна. Экология растений : учебное пособие для студентов вузов, обучающихся по специальности "Экология" и по направлению...
Стабильные изотопы и экология iconПрограмма-минимум кандидатского экзамена по специальности 25. 00. 36 «Геоэкология»
«Общая экология», «Геология месторождений полезных ископаемых», «Технология добычи и переработки полезных ископаемых», «Экологическое...
Стабильные изотопы и экология iconУчебное пособие написано в соответствии с Государственным образовательным стандартом и программой по экологии. Книга состоит из трех частей: учение о биосфере, общая экология, прикладная экология.
Экология : учеб пособие : рек. Умо/ С. И. Колесников. 3-е изд М.: Дашков и К; Ростов н/Д: Академцентр, 2009. 384 с Библиогр в конце...
Стабильные изотопы и экология iconО. Н. Фёдорова Пояснительная записка Данный курс «Физика и экология»
Данный курс «Физика и экология» входит в образовательную область «Естествознание» и сопровождает различные учебные предметы этого...
Стабильные изотопы и экология iconПрограмма-минимум кандидатского экзамена по специальности 25. 00. 36 «Геоэкология» по техническим наукам
«Общая экология», «Геология месторождений полезных ископаемых», «Технология добычи и переработки полезных ископаемых», «Экологическое...
Стабильные изотопы и экология iconУчебно-методический комплекс по дисциплине Прикладная экология (название)
Учебно-методический комплекс «Прикладная экология» составлен в соответствии с требованиями Государственного образовательного стандарта...
Разместите кнопку на своём сайте:
Библиотека


База данных защищена авторским правом ©lib.znate.ru 2014
обратиться к администрации
Библиотека
Главная страница