Министерство здравоохранения республики казахстан карагандинский государственный медицинский университет




НазваниеМинистерство здравоохранения республики казахстан карагандинский государственный медицинский университет
страница38/45
Дата17.04.2013
Размер2.71 Mb.
ТипДокументы
1   ...   34   35   36   37   38   39   40   41   ...   45

Д. В. Суменкова, Л. М. Поляков, Л. Е. Панин

АПОЛИПОПРОТЕИН Е КАК ВОЗМОЖНЫЙ РЕГУЛЯТОР ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ МАКРОФАГОВ


Научно-исследовательский институт биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, (Новосибирск)


Введение. Известно, что липопротеины плазмы крови и их белковые компоненты участвуют в регуляции многих метаболических процессов [1]. Аполипопротеин Е (апоЕ) известен как ингибитор пролиферации клеток различных тканей, включая опухолевые [2, 3]. Обсуждается гепарансульфат-опосредованный механизм антипролиферативного действия апоЕ [4], его участие в распределении -катенина и сохранении межклеточных взаимодействий в процессе подавления опухолевого роста [5], роль в регуляции экспрессии генов Wnt-сигнального пути, конститутивная активация которого играет важное значение в канцерогенезе [6]. Не исключено, что апоЕ может быть одним из факторов, участвующих в реализации противоопухолевой активности макрофагов. Показано, что содержание апоЕ в макрофагах составляет 10–25% от общего секретируемого этими клетками белка [7]. В последние годы получены данные об участии макрофагов в прогрессии опухоли [8]. Одной из причин функциональной «перестройки» опухоль-ассоциированных макрофагов может быть нарушение механизмов синтеза, процессинга или секреции апоЕ. Целью настоящей работы явилось изучение содержания апоЕ в спектре внутриклеточных белков опухоль-ассоциированных макрофагов.

Материалы и методы исследования. В работе использовали клетки асцитной HA-I гепатомы, полученные от мышей линии A/Sn в лог-фазе опухолевого роста (ИЦиГ СО РАН, Новосибирск) и клетки «перитонеального смыва» здоровых мышей. Выделенные клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 (рН 7,4), содержащей 20 мM HEPES, 2 мM L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл гентамицина, 5,6 мM глюкозы. Макрофаги выделяли из общей клеточной взвеси, используя их выраженные адгезивные свойства. Жизнеспособность клеток составляла не менее 95%. Инкубацию проводили в СО2-инкубаторе в атмосфере, содержащей 5% СО2 и 95% воздуха, при температуре 37 ºС, используя 6-луночные планшеты. Плотность клеток составляла 1,5 тыс. на мм2.

Анализ спектра внутриклеточных белков проводили методом диск-электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях с DS-Na. Белковые полосы визуализировали с помощью Кумасси G-250. В качестве стандарта для определения апоЕ использовали липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП), выделенные из плазмы крови крыс методом изоплотностного ультрацентрифугирования. Для разрушения клеточных мембран использовали лизирующий раствор (10 мМ фосфорнокислый натрий, 85 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,5 % дезоксихолат натрия и 1% Тритон X-100, рН 7,2).

Иммуноэлектроблоттинг проводили «полусухим» методом с использованием нитроцеллюлозных мембран c диаметром пор 0,45 мкм. Специфические антитела к апоЕ получали описанным нами ранее методом [9]. Визуализацию преципитации проводили путем выявления активности пероксидазы хрена с использованием в качестве красителя нитрофенилендиамина. Данные иммуноэлектроблоттинга обрабатывали с помощью компьютерной программы TotalLab.

Результаты исследования и их обсуждение. Электрофоретический анализ внутриклеточных белков макрофагов здоровых мышей и мышей с асцитной HA-I гепатомой показал, что их спектры отличаются между собой (рис. 1). Среди белков опухоль-ассоциированных макрофагов было обнаружено меньшее количество низкомолекулярных форм и повышенное содержание средне- и высокомолекулярных фракций. Белковый банд, соответствующий по молекулярной массе апоЕ (34 кДа), был более выражен в лизате макрофагов здоровых мышей.


Рис. 1. Электрофореграмма внутри-клеточных белков перитонеальных макрофагов мышей. Диск-электрофорез в 12,5% ПААГ с DS-Na, окраска Кумасси:

1 – опухоль-ассоциированные макро-фаги;

2 – макрофаги здоровых мышей;

3 – белки ЛПОНП.



Соответствие изучаемого банда аполипопротеину Е и его количественное преимущество в макрофагах здоровых животных было подтверждено методом иммуноферментного анализа. Результаты иммуноэлектроблоттинга обнаружили в макрофагах наличие двух форм апоЕ, различающихся по молекулярной массе (рис. 2А).




Рис. 2. Анализ внутриклеточного содержания апоЕ в перитонеальных макрофагах мышей:

А – данные иммуноэлектроблоттинга с использованием специфических апоЕ-антител: 1 – опухоль-ассоциированные макрофаги; 2 –макрофаги здоровых мышей; банд 1 – гликозилированная форма; банд 2 – дегликозилированная проформа;

Б – денситометрия бандов апоЕ-иммунореактивности: 1 – банд 1; 2 – банд 2.


Известно, что апоЕ, секретируемый макрофагами, высоко сиалирован, поэтому внутриклеточный пул белка представлен дегликозилированной и гликозилированной проформами. Вероятно, гликозилирование играет важную роль в клеточном процессинге и механизме секреции этого белка. Денситометрический анализ данных иммуноэлектроблоттинга (рис. 2Б) показал, что в опухоль-ассоциированных макрофагах содержание апоЕ в дегликозилированной проформе снижено почти в 2 раза (банд 2).

Добавление экзогенного апоЕ (10 мкг/мл) или апоЕ-содержащих ЛПОНП в культуру клеток HA-I гепатомы приводило к снижению синтеза ДНК в опухолевых клетках, который оценивали по скорости включения 3H-тимидина.

Вывод

Опухоль-ассоциированные макрофаги мышей с асцитной гепатомой отличаются от перитонеальных макрофагов здоровых животных спектром внутриклеточных белков. Снижение содержания апоЕ, обладающего антипролиферативным эффектом, в дегликозилированной проформе может свидетельствовать о нарушении процессов синтеза белка и являться одной из причин снижения противоопухолевой активности макрофагов.

Литература

  1. Поляков Л.М., Панин Л.Е. Липопротеиновая регуляция метаболических процессов [обзор]. Успехи современной биологии 2000; 120 (3):265-72.

  2. Vogel T., Guo N.H., Guy R., Drezlich N., Krutzsch H.C., Blake D.A., et al. Apolipoprotein E: a potent inhibitor of endothelial and tumor cell proliferatin. J Cell Biochem 1994; 54 (3):299-308.

  3. Панин Л.Е., Князев Р.А., Суменкова Д.В., Гуща Р.С., Поляков Л.М. Роль аполипопротеина Е в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в культуре гепатоцитов крыс. Бюллетень СО РАМН 2007; 123 (1):63-6.

  4. Paka L., Goldberg I.J., Obunike J.C., Choi S.Y., Saxena U., Goldberg I.D., et al. Perlecan mediates the antiproliferative effect of apolipoprotein E on smooth muscle cells. An underlying mechanism for the modulation of smooth muscle cells growth? J Biol Chem 1999; 274 (51):36403-8.

  5. Niemi M., Hakkinen T., Karttunen T.J., Eskelinen S., Kervinen K., Savolainen M.J., et al. Apolipoprotein E and colon cancer. Expression in normal and malignat human intestine and effect on cultured human colonic adenocarcinoma cells. Eur J Intern Med 2002; 13 (1):37-43.

  6. Caruso A., Motolese M., Iacovelli L., Caraci F., Copani A., Nicoletti F., et al. Inhibition of the canonical Wnt signaling pathway by apolipoprotein E4 in PC12 cells. J Neurochem 2006; 98 (2):364-71.

  7. Werb Z., Chin J.R., Takemura R., Oropeza R.L., Bainton D.F., Stenberg P., et al. The cell and molecular biology of apolipoprotein E synthesis by macrophages. Ciba Found Symp 1986; 118:155-71.

  8. Prehn T. An immune reaction may be necessary for cancer development. Theor Biol and Med Modeling 2006; 3 (6):10-21.

  9. Панин Л.Е., Русских Г.С., Поляков Л.М. Обнаружение иммуно-реактивности к аполипопротеинам А-I, В и Е в ядрах клеток тканей крыс. Биохимия 2000; 65 (12):1684-9.



1   ...   34   35   36   37   38   39   40   41   ...   45

Похожие:

Министерство здравоохранения республики казахстан карагандинский государственный медицинский университет icon1. Линейные элементы электронных схем
Министерство образования и науки республики казахстан карагандинский государственный технический университет
Министерство здравоохранения республики казахстан карагандинский государственный медицинский университет icon1. Линейные элементы электронных схем
Министерство образования и науки республики казахстан карагандинский государственный технический университет
Министерство здравоохранения республики казахстан карагандинский государственный медицинский университет iconМинистерство образования и науки республики казахстан карагандинский государственный технический университет
Программа вступительного экзамена по дисциплине «Основы технической эксплуатации тт»
Министерство здравоохранения республики казахстан карагандинский государственный медицинский университет iconРеспублики Казахстан Карагандинский государственный технический университет
Государственная программа развития образования в Республике Казахстан на 2011 – 2020 годы
Министерство здравоохранения республики казахстан карагандинский государственный медицинский университет iconМинистерство образования и науки республики казахстан карагандинский государственный технический университет
Перечень дисциплин вступительного экзамена для магистрантов по специальности 6М090100 «Организация перевозок, движения и эксплуатация...
Министерство здравоохранения республики казахстан карагандинский государственный медицинский университет iconН ациональный банк республики казахстан карагандинский филиал пресс релиз №3
Карагандинский филиал Государственного учреждения «Национальный Банк Республики Казахстан» информирует об объявлении Национальным...
Министерство здравоохранения республики казахстан карагандинский государственный медицинский университет iconПрограмма и задания вступительного экзамена для магистрантов по специальности 6М073100 безопасность жизнедеятельности и защита окружающей среды кафедры: «Рудничная аэрология и охрана труда»
Министерство образования и науки республики казахстан карагандинский государственный технический университет
Министерство здравоохранения республики казахстан карагандинский государственный медицинский университет iconПрограмма и задания вступительного экзамена для магистрантов по специальности 6М073100 безопасность жизнедеятельности и защита окружающей среды кафедры: «Рудничная аэрология и охрана труда»
Министерство образования и науки республики казахстан карагандинский государственный технический университет
Министерство здравоохранения республики казахстан карагандинский государственный медицинский университет iconРеспублики Казахстан Карагандинский государственный технический университет
О реализации учебных, научных и исследовательских программ в рамках инновационного консорциума «Корпоративный Университет»
Министерство здравоохранения республики казахстан карагандинский государственный медицинский университет iconРеспублики Казахстан Карагандинский Государственный Технический Университет
Программа вступительного экзамена по дисциплине «Алгоритмизация и программирование»
Разместите кнопку на своём сайте:
Библиотека


База данных защищена авторским правом ©lib.znate.ru 2014
обратиться к администрации
Библиотека
Главная страница