Молекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот yddg escherichia coli




Скачать 332.33 Kb.
НазваниеМолекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот yddg escherichia coli
страница1/4
Дата02.12.2012
Размер332.33 Kb.
ТипАвтореферат
  1   2   3   4
На правах рукописи


ЦЫРЕНЖАПОВА ИРИНА СЕРГЕЕВНА


МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ЭКСПОРТЕРА АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОКИСЛОТ YddG

ESCHERICHIA COLI


03.01.03. – Молекулярная биология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Москва – 2010


Работа выполнена в лаборатории №4 Закрытого Акционерного Общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»)


Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Дорошенко Вера Георгиевна

ЗАО «АГРИ»


Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Вейко Владимир Петрович

ФГУП «ГосНИИгенетика»


доктор биологических наук, доцент Голденкова-Павлова

Институт общей генетики Ирина Васильевна

им. Н.И. Вавилова РАН


Ведущая организация:

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева


Защита диссертации состоится «____» декабря 2010 г. в 1400 на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».


Автореферат диссертации разослан «____» ноября 2010 г.


Ученый секретарь

Диссертационного совета,

кандидат химических наук Т. Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность проблемы. Значительные успехи последних десятилетий в производстве аминокислот связаны, прежде всего, с конструированием микроорганизмов-продуцентов методами метаболической инженерии. Такой способ конструирования включает в себя последовательное целенаправленное изменение метаболизма клетки для раскрытия ее возможностей к сверхсинтезу конкретной аминокислоты и должен быть основан на молекулярно-генетической характеристике участвующих в нем элементов.

Escherichia coli, в силу ее генетической и биохимической изученности и из-за разработанности методов манипулирования с ее геномом, является удобным микрорганизмом для рационального конструирования на ее основе штаммов-продуцентов различных биологически активных соединений и, прежде всего, аминокислот. Для последних можно не изобретать новый путь биосинтеза: клетка E. coli синтезирует для своих нужд все 20 аминокислот. Для получения суперпродукции конкретной аминокислоты ликвидируют контролирующие элементы ее синтеза и перестраивают общий метаболизм клетки для увеличения синтеза ее предшественников. При достижении определенного уровня продукции аминокислоты актуальной проблемой становится ее транспорт из клетки. Усиление активного экспорта аминокислоты из клетки в настоящее время достигается за счет увеличения экспрессии гена аминокислотного экспортера. Несмотря на то, что в последние два десятилетия идентифицированы десятки генов, кодирующих экспортеры аминокислот у промышленно значимых бактерий E. coli и Corynebacterium glutamicum, их детальное исследование только начинается.

В частности, объектом исследования данной работы является экспортер ароматических аминокислот YddG E. coli. На момент начала исследования было показано, что амплификация гена yddG придает клеткам E. coli устойчивость к ароматическим аминокислотам и их аналогам, а также увеличивает накопление ароматических аминокислот в культуральной жидкости продуцирующих их штаммов (Doroshenko et al., 2007).

Идентификация регуляторных элементов гена yddG и возможных факторов, влияющих на его экспрессию, представляла интерес и могла иметь практическое применение для оптимизации экспрессии гена yddG в штаммах-продуцентах ароматических аминокислот.

Экспортеры аминокислот относятся к интегральным мембранным белкам. Они высокогидрофобны, состоят из нескольких α-спиральных структур, которые образуют трансмембранные (ТМ) сегменты. Такие особенности мембранных белков затрудняют экспериментальный анализ их трехмерных структур, поэтому построение топологических моделей, т.е. определение количества ТМ сегментов и их ориентации в мембране является важным этапом исследования интегральных мембранных белков. К началу данной работы отсутствовали экспериментально подтвержденные топологические модели известных экспортеров аминокислот E. coli. Таким образом, несомненный интерес представляло экспериментальное определение топологии экспортера ароматических аминокислот YddG. Полученные результаты могли быть использованы для разработки новых стратегий оптимизации аминокислотных экспортеров в цитоплазматической мембране штаммов-продуцентов аминокислот.


Цели и задачи исследования. Таким образом, целью настоящей диссертационной работы было изучение регуляции гена yddG и характеристика YddG как интегрального мембранного белка.


В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

  1. Провести идентификацию промотора гена yddG;

  2. Разработать систему и исследовать регуляцию гена yddG in vivo;

  3. Исследовать локализацию YddG в клетке;

  4. Построить топологическую модель YddG.


Научная новизна и практическая ценность работы. Картирован промотор гена yddG, исследована экспрессия этого гена in vivo в различных условиях культивирования. Ген yddG экспрессируется в клетках E. coli MG1655 на низком уровне, что следует как из анализа его регуляторной области, так и из тестирования активности LacZ для гибридного гена yddG’-lacZ. Увеличение экспрессии гена yddG наблюдалось в условиях, приводящих к замедлению роста клеток E. coli. Неблагоприятные или стрессовые условия, замедляющие рост культуры, индуцировались такими факторами, как ингибирующие концентрации фенилаланина, NaCl или сахарозы в среде. Экспрессия yddG в этих условиях не зависела от σS-РНК полимеразы.

С помощью сконструированных гибридных белков YddG-LacZ и YddG-ZsGreen экспериментально доказана локализация YddG в цитоплазматической мембране E. coli. Построена топологическая модель YddG. Экспериментально показано наличие у YddG 10 ТМ и расположение N- и C-концов в цитоплазме. С помощью флуоресцентной микроскопии установлено, что YddG локализуется на полюсах клетки.

В результате замены природной регуляторной области yddG на эффективную регуляторную область оптимизирована экспрессия гена yddG в клетках продуцентов фенилаланина. Генетические конструкции с повышенной экспрессией гена yddG введены в штаммы-продуценты ароматических аминокислот, которые используются в биотехнологическом производстве.


Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК, и 1 патентная заявка.

Материалы диссертации докладывались на конкурсе работ сотрудников ЗАО «АГРИ» (июнь 2007), были представлены на IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008) и Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008).

Диссертация апробирована на совместном заседании секций «Молекулярная биология» и «Генетика микроорганизмов» Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика» и Научно-технического совета НИИ «Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ») 5 октября 2010 г.


Благодарности. Автор искренне признателен к.б.н. Айрих Л.Г. за сотрудничество и практическую помощь в методологии исследования YddG. Автор благодарит д.б.н., проф. Миронова А.С. (ФГУП «ГосНИИгенетика») за оказанное содействие в постановке экспериментов по определению стартовой точки транскрипции; д.б.н., доцента Феофанова А.В. и Воронцову О.В. (Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова) за помощь при проведении флуоресцентной микроскопии клеток E. coli. Автор признателен также к.б.н. Казаковой С.М. и Кулагиной Ю.В. (ЗАО «АГРИ») за содействие в проведении культивирований штаммов-продуцентов в ферментерах.

Особую благодарность автор выражает своему руководителю к.б.н., доценту Дорошенко В.Г., а также д.б.н., проф. Машко С.В., способствовавшему выполнению данной диссертационной работы.


Структура и объем работы. Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на _____ страницах, включая _____ рисунков и ____ таблиц. Список литературы содержит _____ цитируемых источников, в том числе _____ на русском языке.


СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ


Бактериальные штаммы и среды. Все штаммы E. coli, использованные в работе, были получены на основе MG1655 (F-, λ-, rph-1) или BW25113 (lacIq rrnBT14 lacZWJ16 hsdR514 ∆araBA-DAH33rhaBADLD78). Штаммы выращивали на средах известного состава (Sambrook and Russell, 2001): LB, SOB или минимальной среде М9 с глюкозой (0.4%) или глицерином (0.8%) в качестве источников углерода и добавлением при необходимости L-аминокислот (5 мМ). Для плотных сред использовали агар (1.5%). Антибиотики добавляли в концентрациях (мкг/мл): хлорамфеникол (Cm) – 25, ампициллин (Ap) – 100, тетрациклин (Tc) – 12.5.

Конструирование штаммов. Все модификации (делеции, инсерции, замены) хромосомы были выполнены прецизионно с помощью Red системы фага  (Datsenko and Wanner, 2000) и удаляемого in vivo маркера CmR (ген cat), находящегося в составе фрагмента lattL-cat-lattR (Doroshenko et al., 2007). При делетировании генов сохраняли рамку считывания.

Этапы получения гибридного гена yddG’-lacZ схематично представлены на Рис. 1. В клетки MG1655lacZ PL-yddG интегрировали lacZ таким образом, что в полученной конструкции гибридного гена yddG’-lacZ к первым 15 нуклеотидам yddG была присоединена последовательность lacZ без ATG-кодона. Для отбора клонов, содержащих интегрированные в хромосому фрагменты, использовали как маркер CmR, так и ген левансахаразы Bacillus subtilis sacB. Последний маркер, ген которого находился под контролем промотора лактозного оперона E. coli (Plac), позволял отбирать замещающие его целевые фрагменты ДНК на среде с сахарозой (20%).





Рис. 1. Схема получения гена гибридного белка YddG-LacZ в хромосоме E. coli: a. Замещение регуляторной области гена yddG на PL-RBSlacZ; б. Замещение гена yddG на yddG’-lacZ; в. Интеграция cat-sacB вместо attB-PL, селекция колоний CmR; г. Замещение cat-sacB на исходную регуляторную область yddG, отбор колоний на среде с сахарозой.


Условия культивирования и определение фенилаланина в культуральной жидкости. Аэробное культивирование штаммов-продуцентов фенилаланина проводили в ферментерах Biostat Q (1 л, BBI, Германия) в 0.3 л среды: 50 г/л глюкозы, 0.6 г/л (NH4)2SO4, 0.6 г/л KH2PO4, 10 мг/л FeSO4, 10 мг/л MnSO4, 2 г/л дрожжевого экстракта и 125 мг/л тирозина. Клетки культивировали при 37ºС, уровень pH 6.7 поддерживали добавлением NH4OH. Посевные культуры (0.03 л) выращивали в 0.75 л колбах в среде LB с перемешиванием (240 об/мин). Концентрацию фенилаланина в культуральной жидкости определяли с помощью ВЭЖХ.

Культивирование в пробирках штаммов-продуцентов фенилаланина проводили аэробно (240 об/мин) при 34ºС в течение ~26 ч (до истощения глюкозы) в среде следующего состава: 40 г/л глюкозы, 2 г/л дрожжевого экстракта, 16 г/л (NH4)2SO4, 0.6 г/л KH2PO4, 10 мг/л FeSO4, 8 мг/л MnSO4, 30 г/л CaCO3 и 125 мг/л тирозина. Концентрация фенилаланина в среде определялась с помощью тонкослойной хроматографии.

Конструирование рекомбинантных плазмид. Для определения стартовой точки транскрипции ген yddG с собственной регуляторной областью (280 п.н.) клонировали в многокопийной плазмиде pMDV3 (репликон pUC). Фрагмент ДНК для клонирования получали с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК штамма MG1655 и специально сконструированные праймеры. Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды, были устойчивы к L-фенилаланину (30 мг/мл).

Для получения плазмиды pMW118-tyrR (репликон pSC101) ген tyrR с собственной регуляторной областью (150 п.н.) амплифицировали с помощью ПЦР с хромосомной ДНК штамма MG1655.

Для получения плазмиды pBRyddG-blaM ген гибридного белка Plac-yddG-blaM клонировали в pBR322. Предварительно фрагмент ДНК Plac-yddG-blaM был сконструирован с помощью перекрывающейся ПЦР. Фрагменты ДНК, содержащие полноразмерный ген yddG или промотор Plac, амплифицировали с хромосомной ДНК штамма MG1655. Фрагмент ДНК, содержащий ген blaM, а также ген ZsGreen (см. ниже) амплифицировали с ДНК плазмиды pZsGreen (Clontech).

Для конструирования плазмид pBRyddG’-blaM, содержащих укороченные варианты гена yddG, между генами yddG и blaM на плазмиде pBRyddG-blaM были предусмотрены сайты рестрикции NcoI и SacI. Для получения таких плазмид ДНК pBRyddG-blaM обрабатывали рестриктазами NcoI и SacI, в результате чего между генами yddG и blaM образовывался разрыв с 5’- и 3’-выступающими концами ДНК. Далее использовали эндонуклеазу III, которая гидролизовала одну цепь ДНК только с 5'-выступающего конца. Чтобы получить различные делеционные варианты, отбирали аликвоты с интервалом 45 сек (при 30ºC), обрабатывали S1 нуклеазой и проводили достройку выступающих концов ДНК с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli и лигирование.

Для конструирования плазмид pBRyddG-ZsGreen, в которых варианты кодирующей области yddG заданной длины были соединены с полноразмерным ZsGreen, фрагменты ДНК Plac-yddG’-ZsGreen получали с помощью перекрывающейся ПЦР.

Структуры всех полученных плазмид были подтверждены с помощью секвенирования.

Манипуляции с ДНК и РНК, включая определение стартовой точки транскрипции (primer extension) проводили согласно руководству (Sambrook and Russell, 2001). Концентрацию РНК определяли, измеряя отношение абсорбции при 260/280 нм.

Определение активности β-галактозидазы проводили с использованием О-нитрофенил-β-D-галактопиранозида (Sigma) в качестве субстрата (Миллер, 1976). Измеренная активность клеточных экстрактов приведена в единицах Миллера (ЕМ).

Определение устойчивости клеток TG1 (pBRyddG-blaM) к ампициллину. Клетки выращивали в среде LB до середины логарифмической фазы (3×108 кл/мл), затем отмывали свежей средой и высевали на агаризованную среду LB, содержащую 0, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 мкг/мл Ap и 1 мМ ИПТГ (100-400 клеток на чашку).

Измерение флуоресценции. Флуоресценцию клеток штамма E. coli TG1 (pBRyddG-ZsGreen) определяли, выращивая клетки в среде LB до середины логарифмической фазы (3×108 кл/мл) в присутствии 1 мМ ИПТГ. Измерение флуоресценции белка ZsGreen проводили с помощью спектрофлуорофотометра Synergy 2 (BioTek Instruments, Inc., USA).

Выделение фракции мембранных белков. Мембранные фракции выделяли согласно протоколу Rouanet & Nasser (2001). Для растворения полученных мембранных белков добавляли Triton X-100 до концентрации 2% и инкубировали 1 ч при 4ºС. Концентрацию белка определяли по Bradford (1976).

Иммуноблоттинг. Белки разделяли в 0.1% ДСН – 12% ПААГ и переносили на PVDF-мембрану с помощью Trans-Blot SD semidry transfer cell (Bio-Rad). В качестве первичных антител использовали мышиные анти-β-лактамазные (Abcam) и анти-RCFP (Clontech) антитела. В качестве вторичных антител использовали анти-мышиные и анти-кроличьи коньюгаты с щелочной фосфатазой (Sigma) соответственно.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Микрофотографии клеток штамма E. coli TG1 были получены с помощью микроскопа LSM510 META (Carl Zeiss) с водно-иммерсионным объективом 63×/1.2 NA C-Apochromat. Флуоресценция детектировалась с помощью оптического ответвителя HFT UV/488/543/633 через фильтр LP505.

  1   2   3   4

Похожие:

Молекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот yddg escherichia coli iconApplication of the photocatalytic reaction of TiO2 to disinfection and the killing of Escherichia coli bacteria

Молекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот yddg escherichia coli iconDna fingerprinting analysis of escherichia coli to investigate potential fecal pollution sources impacting st. Joseph beach water

Молекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот yddg escherichia coli iconBelkin, S., D. R. Smulski, et al. (1996). "Oxidative stress detection with Escherichia coli harboring a katG':: lux fusion." Applied and Environmental

Молекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот yddg escherichia coli iconТеоретическое исследование механизмов функционирования и регуляции цикла Кребса митохондрии и Escherichia coli
Работа выполнена в Институте физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского мгу им. М. В. Ломоносова
Молекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот yddg escherichia coli iconЭкстракция и определение ароматических α -аминокислот и водорастворимых витаминов закономерности и новые аналитические решения
Аминокислот и водорастворимых витаминов – закономерности и новые аналитические решения
Молекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот yddg escherichia coli iconЛекция тема: Обмен белков и аминокислот
Цель лекции: ознакомить студентов с путями расходования аминокислот в клетке, с реакцими трансаминирования и декарбоксилирования,...
Молекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот yddg escherichia coli iconЛекция 3 аминокислоты
Известно несколько сотен аминокислот. Важнейшими являются 20 аминокислот, входящих в состав белков, их называют протеиногенными....
Молекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот yddg escherichia coli iconИсследование нетермического воздействия терагерцового излучения на геносенсорные клетки E. coli/pKatG-gfp и E. coli/pСopA-gfp

Молекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот yddg escherichia coli iconСанитарные нормативы: Методические указания (мук). Методы контроля. Биологические и физические факторы
Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых...
Молекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот yddg escherichia coli iconРабочая программа дополнительного профессионального образования по направлению «днк-идентификация личности»
Молекулярно-генетическая идентификация личности по маркерам ядерной и митохондриальной ДНК
Разместите кнопку на своём сайте:
Библиотека


База данных защищена авторским правом ©lib.znate.ru 2014
обратиться к администрации
Библиотека
Главная страница