Способ тушения собственной флуоресценции белков




Скачать 97.63 Kb.
НазваниеСпособ тушения собственной флуоресценции белков
Дата07.09.2012
Размер97.63 Kb.
ТипДокументы


G01N33/52


Способ тушения собственной флуоресценции белков

Авторы:

Грищенко Валентин Иванович, Дорошенко Андрей Олегович, Дюбко Татьяна Станиславовна


Изобретение относится к области биофизики и может быть использовано для исследования конформационных изменений белков методом флуоресцентной спектроскопии.

Для решения ряда биофизических задач, связанных с изучением методом флуоресцентной спектроскопии изменения конформационного состояния биомакромолекул, вызванных действием различных физико-химических факторов, используются не только явление собственной флуоресценции белков или люминесцентные красители-зонды, но и эффективные тушители - вещества, приводящие к безызлучательному рассеиванию энергии электронного возбуждения. На эффекте тушения собственной флуоресценции биологических макромолекул, в частности, водорастворимых и мембранных белков, построен ряд методик, дающих информацию об изменении конформации белковых макромолекул под воздействием внешних факторов [1].

Известен способ тушения собственной флуоресценции белков с помощью синглетного кислорода, который тушит флуоресценцию почти всех известных флуорофоров [1]. Однако, при осуществлении этого способа возникает ряд технических и метрологических трудностей, связанных с экспериментальными неудобствами работы с газами и необходимостью изоляции образцов от окружающей кислородной атмосферы [2].

Известен способ тушения собственной флуоресценции белков с использованием йодида калия [3]. Одним из недостатков этого способа является то, что «действующее начало» иодида калия – анион I- несет на себе отрицательный заряд, вследствие чего он не проникает вглубь белковой молекулы и способен тушить флуоресценцию только поверхностных ароматических остатков белков (преимущественно по статическому механизму – путем образования нелюминесцирующего комплекса). Это не позволяет изучать с помощью йодида калия состояние глубоко расположенных участков белковых глобул, а также интегральных белков, входящих в состав биомембран. Недостатком также является необходимость работы при высоких концентрациях йодида калия, вследствие чего в растворе создаются высокие значения ионной силы, при которых может начаться денатурация белковых молекул.

Наиболее близким к заявляемому является способ тушения собственной флуоресценции белков с применением акриламида [2]. Акриламид, являясь нейтральной незаряженной молекулой, способен проникать внутрь белковых молекул и тушить собственную флуоресценцию белков по динамическому механизму.


Способ состоит в том, что раствор исследуемого белка титруют небольшими количествами (по 5-10 мкл) концентрированного (обычно 3–10 М) раствора акриламида. Для каждой добавленной концентрации на спектрофлуориметре регистрируют интенсивность флуоресценции белка в максимуме и после окончания титрования по полученным данным строят график Штерна-Фольмера, по наклону которого судят об эффективности тушения, а также вычисляют значение константы тушения (KSV) [2].

К недостатками этого способа можно отнести:

– недостаточную чувствительность к конформационному состоянию некоторых изолированных белков [4], белковых смесей, а также белков, встроенных в мембраны клеток [5];

– высокие концентрации (3 М и более) используемого раствора акриламида, которые могут нарушать конформационное состояние исследуемых белков [6];

– высокая токсичность акриламида [7], требующая специальных мер предосторожности при работе с ним и представляющая опасность для состояния здоровья исследователя.

В основу изобретения поставлена задача создания такого способа тушения собственной флуоресценции белков, в котором замена тушителя позволит повысить чувствительность метода, уменьшить токсическое воздействие, оказываемое тушителем на исследуемый объект и на исследователя.

Поставленная задача решается тем, что в способе тушения собственной флуоресценции белков, включающем титрование исследуемого образца раствором тушителя, относящегося к α,β-ненасыщенным амидам, измерение интенсивности флуоресценции белка и определение константы тушения Штерна-Фольмера (KSV), согласно изобретению, в качестве тушителя используют спиртовый раствор 2-метил-5-нитро-изохинолон-1(2Н) (далее – ИКС-5) с начальной концентрацией 4–4,5х10–3 М.

Органическое соединение ИКС-5 представляет собой N-метилированный нитрозамещенный циклический амид вида:

ИКС-5 не обладает собственной флуоресценцией в УФ-области в водных и спиртовых растворах, однако эффективно тушит флуоресценцию белков, находящихся в водном растворе и в составе биологических мембран. Спектр поглощения ИКС-5 расположен в диапазоне излучения основных белковых флуорофоров – аминокислотных остатков тирозина и триптофана, следовательно ИКС-5 способен к безызлучательной дезактивации их возбужденных состояний по механизму синглет-синглетного индуктивно-резонансного переноса энергии. Кроме того, наличие в молекуле ИКС-5 сильного электроноакцепторного заместителя,– нитрогруппы, обусловливает возможность тушения возбужденных состояний находящихся в непосредственной близости от нее органических флуорофоров по механизму фотопереноса электрона. Благодаря своей химической структуре ИКС-5 легко проникает в биополимер и обеспечивает эффективное тушение собственной флуоресценции ароматических остатков белка по механизмам индуктивно-резонансного переноса энергии и переноса электрона. ИКС-5 является малотоксичным веществом и работа с ним не требует специальных мер предосторожности.


Применение ИКС-5 для тушения собственной флуоресценции водорастворимых и мембраносвязанных белков позволяет:

– повысить чувствительность метода к конформационным изменениям белков, находящихся в растворе и входящих в состав биомембран;

– снизить повреждающее воздействие на исследуемый объект благодаря снижению количества тушителя, вводимого в исследуемый биообъект;

– уменьшить возможность токсического воздействия тушителя на исследователя.

Способ осуществляют следующим образом.

Водный раствор исследуемого белка (суспензию мембран или целых клеток) объемом 3 мл титруют порциями (по 5 мкл) спиртового раствора ИКС-5 с начальной концентрацией 4х10–3 М. Для каждой добавленной концентрации ИКС-5 на спектрофлуориметре регистрируют интенсивность флуоресценции белка в максимуме и после окончания титрования по полученным данным строят график Штерна-Фольмера, по наклону которого судят об эффективности тушения, а также вычисляют значение константы тушения (KSV) по формуле [8]:


Fо /F = 1 + KSV [Q],

(1)


где Fо и F — интенсивности флуоресценции соответственно в отсутствии и при наличии тушителя; [Q] — концентрация тушителя.


Предложенный способ тушения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. (Тушение флуоресценции БСА)

Раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) ("Sigma", США) обьемом 3,0 мл с концентрацией 410–5 М, приготовленный на 5 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, титровали порциями по 5 мкл раствором ИКС-5 с начальной концентрацией 410–3 М (растворенным в 0,5 мл спирта). Для сравнения титрование белка было проведено также порциями по 5 мкл 10 М акриламидом. Тушение флуоресценция водного раствора БСА наблюдалось по падению флуоресценции раствора БСА в максимуме его спектра (при длине волны 340 нм) при увеличении концентрации ИКС-5 в титруемом растворе от 9,510–6 до 5,710–5 М без изменения формы и положения спектра. Константу Штерна—Фольмера (KSV) вычисляли по уравнению (1).

Вычисленные значения KSV для тушителя и акриламида составили соответственно: 108,3х105 М-1 и 22,7 М-1.


Пример 2. (Тушение флуоресценции БСА, денатурированного мочевиной)

С использованием ИКС-5 титровали два водных раствора БСА: контрольный и опытный (денатурированный 4 М мочевиной) как описано в примере 1. Контрольный раствор готовили аналогично описанному в примере 1. К опытному раствору добавляли мочевину в конечной концентрации 4 М. При этом флуоресценция контрольного и опытного растворов БСА тушилась, что наблюдалось по падению интенсивности обоих образцов при длине волны 340 нм (возб =280 нм) с ростом концентрации ИКС-5 в титруемом растворе от 9,510–6 до 5,710–5 М.

Эффективность тушения определяли по уравнению (1) путем вычисления константы тушения флуоресценции (KSV). Вычисленные значения KSV для тушения ИКС-5 контрольного и денатурированного мочевиной образцов САБ составили соответственно: 108,5х105 М-1 и ........М-1.

Пример 3. (Тушение флуоресценции белков плазмы крови. Влияние замораживания)

Плазму отделяли от эритроцитов цельной крови центрифугированием при 3000 g в течение 5 мин (контроль). Опытный образец плазмы подвергали быстрому погружению в жидкий азот (-196 оС) с последующим отогревом при перемешивании на водяной бане (40 оС). В обоих случаях плазму крови разводили в 40 раз 5 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 7,4.

С использованием ИКС-5 титровали два образца плазмы крови донора: контрольный и опытный. Тушение обоих растворов осуществляли ИКС-5 как описано в примере 1. При этом флуоресценция контрольного и опытного растворов плазмы крови тушилась, что наблюдали по падению флуоресценции плазмы при длине волны в области 332-345 нм (возб =280 нм) с ростом концентрации ИКС-5 в титруемом растворе от 9,510–6 до 5,710–5 М.

Эффективность работы тушителя определяли по уравнению (1). Вычисленные значения KSV для тушения с помощью ИКС-5 контрольного и опытного образцов составили соответственно: 107,5х105 М-1 и 102,2х105 М-1.


Пример 4. (Тушение флуоресценции белков эритроцитов цельной крови в присутствии солей)

Эритроциты отмывали от плазмы физиологическим раствором трехкратным центрифугированием (10 мин, 3000 g). В опытный образец добавляли соль (KCl) до конечной концентрации 4 М. В обоих случаях эритроциты разводили в 1000 раз 5 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 7,4.

С помощью спиртового раствора ИКС-5, имевшего концентрацию 4,510–3 М, титровали два образца суспензии эритроцитов донора, предварительно отмытые от плазмы: контрольный и опытный как описано в примере 1. При этом флуоресценция контрольного и опытного образцов тушилась, что было видно по падению флуоресценции эритроцитов при длине волны в области 325-330 нм (возб =280 нм) с ростом концентрации ИКС-5 в титруемом растворе от 7,510–6 до 6,010–5 М. Вычисленные по уравнению (1) значения KSV для тушения ИКС-5 контрольного и опытного образцов эритроцитов донора составили соответственно: 15,4х105 М-1 и М-1.


Как следует из примеров, значения констант тушения (KSV) для ИКС-5 превышают аналогичные показатели для акриламида более чем в 105 раз. Это свидетельствует о более высокой эффективности нового тушителя при его значительно меньшем количестве, что обеспечивает меньшее повреждающее действие на сам исследуемый объект.

Предлагаемый способ не требует дополнительных специальных устройств, может быть использован на стандартных спектрофлуориметрах и, таким образом, является полностью готовым к практическому применению.


Источники информации:

1. Kautsky H. Quenching of luminescence by oxygen // Trans. Faraday Soc.– 1939.– V. 35.– P. 216.

2. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии.- М.: Мир, 1986.– С. 263-273.

3. Eftink M.R., Chiron C.A., Fluorescence quenching of indole and model micelle systems // J. Phys. Chem.– 1976.– V. 80.– P. 486.

4. Jullien M., Garel J.R., Merola F., Brochon J.C. Quenching by acrylamide and temperature of a fluorescent probe attached to the active site of ribonuclease // Eur. Biophys J.– 1986.– Vol. 13, № 3.– P. 131-137.

5. Caputo G.A., London E. Using a novel dual fluorescence quenching assay for measurement of tryptophan depth within lipid bilayers to determine hydrophobic alpha-helix locations within membranes // Biochemistry.– 2003.– Vol. 42, № 11.– P. 3265-3274.

6. Dobryszycki P., Rymarczuk M., Bulaj G., Kochman M. Effect of acrylamide on aldolase structure. I. Induction of intermediate states // Biochim. Biophys Acta.– 1999.– Vol. 1431, № 2.– P. 338-350.

7. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.– С. 376.

8. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии.– М.: Мир, 1986.– С. 56.

Реферат


Способ тушения собственной флуоресценции белков относится к области биофизики и может быть использован для исследования конформационных изменений белков методом флуоресцентной спектроскопии. Тушение осуществляют путем титрования водного раствора белка или белков, находящихся в составе мембран клеток предварительно растворенным в спирте 2-метил-5-нитро-изохинолон-1(2Н) в концентрации 4–4,510–3 М. Способ позволяет тушить флуоресценцию белков как в водном растворе так и в составе клеточных мембран, изучать исследуемые объекты в солевых средах или средах, содержащих органические добавки, при этом он обладает высокой чувствительностью и позволяет уменьшить негативное влияние тушителя на объект исследования и на исследователя.

Формула изобретения


Способ тушения собственной флуоресценции белков, включающий титрование исследуемого образца раствором тушителя, относящегося к α,β-ненасыщенным амидам, измерение интенсивности флуоресценции белка и определение константы тушения Штерна-Фольмера, который отличается тем, что в качестве тушителя используют 2-метил-5-нитро-изохинолон-1(2Н) в начальной концентрации 4–4,510–3 М.




Похожие:

Способ тушения собственной флуоресценции белков iconИзучение комплексобразования моно и дианионов салициловой кислоты с ионом Cu2+ в водных растворах методом тушения флуоресценции

Способ тушения собственной флуоресценции белков icon16. Переваривание белков и обмен азота
Общая схема катаболизма белков от поступления пищевых белков до катаболизма аминокислот в клетках. Заменимые и незаменимые аминокислоты....
Способ тушения собственной флуоресценции белков iconЛитература: Лекция по теме «Протеолиз»
...
Способ тушения собственной флуоресценции белков iconЛекция 9 Взаимодействия определяющие структуру молекул белков
Согласованность структуры белков по ближним взаимодействиям. Согласованность локальных и дальних по цепи, взаимодействий. Энергетика...
Способ тушения собственной флуоресценции белков iconКонтрольная работа №1 (Химия белков, витамины, ферменты, обмен белков и нуклеотидов) Дать определение третичной структуры белков. Указать типы связей, ее стабилизирующие
...
Способ тушения собственной флуоресценции белков iconКурсовая работа по дисциплине «Физико-химические основы развития и тушения пожаров»
Целью курсовой работы является привитие навыков использования теоретических знаний, полученных при изучении дисциплин «Теория го-...
Способ тушения собственной флуоресценции белков iconПлан: Взаимосвязь обменов веществ: Образование углеводов из белков и белков из углеводов
Пути взаимосвязи обменов белков, углеводов и липидов. Общие источники энергии и общие промежуточные продукты. Общие пути распада....
Способ тушения собственной флуоресценции белков iconАнализ состояния процесса управления производством стекла флоат-способом
В нашей стране получили распространение лодочный способ вертикального вытягивания, безлодочный способ вертикального вытягивания,...
Способ тушения собственной флуоресценции белков iconУрок химии по программе О. С. Габриеляна 10 класс «Строение, свойства и функции белков»
...
Способ тушения собственной флуоресценции белков iconПлан самостоятельной внеаудиторной работы по биохимии для студентов педиатрического факультета на осенний семестр 2012-2013 уч года
Активный центр белков и его взаимодействие с лигандами. Доменная структура и ее роль в функционировании белков
Разместите кнопку на своём сайте:
Библиотека


База данных защищена авторским правом ©lib.znate.ru 2014
обратиться к администрации
Библиотека
Главная страница