Определение предмета молекулярная биология




НазваниеОпределение предмета молекулярная биология
страница7/11
Дата05.09.2012
Размер1.82 Mb.
ТипДокументы
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11
именно полимераза III является репликазой, т.е. она синтезирует in vivo новые цепи ДНК.

Участие ДНК-полимеразы I необходимо. У нее вспомогательная, репаративная функция.

ДНК-полимераза II имеет отношение лишь к репарации.

Схема прерывистой антипараллельной репликации Рейджи Оказаки

1968 г.

Исходные посылки: все данные Корнберга, полученные в ферментативной системе in vitro, и "картинки" Кэрнса верны ( но картинки неправильно интерпретированы).

Оказаки специально разработал два новых метода исследования.

1. Метод импульсного мечения.
До
Оказаки метку давали в культуральную среду и быстро начинали отмывать клетки, но минимальное время подачи метки было 5 мин. Оказаки через нужный момент времени после добавления меченого тимидина давал 1000-кратный избыток холодного (немеченого) тимидина. Таким образом, метка включается только в течение очень короткого времени.

Оказаки считал, что время Кэрнса (5 мин.) очень велико для получения истинной картины происходящего при репликации.

2. Центрифугирование в щелочном градиенте сахарозы.
Сахароза
разводится на щелочи. В щелочной среде происходит денатурация ДНК. В этом случае короткие фрагменты ДНК, если они есть, отделяются от длинных. После этого их можно выявить при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы, разделяющем молекулы по молекулярному весу.

Оказаки предположил, что синтез ДНК идет короткими фрагментами и что короткие фрагменты должны сшиваться.

Сшиваются они лигазой. ДНК-лигаза была обнаружена как у прокариот, так и у эукариот. У E. сoli были найдены мутанты по лигазе.

Оказаки провел эксперимент на бактериях, зараженных фагом Т4, у которого есть своя термочувствительная лигаза, которая работает при 20С и не работает при 43С. Если в клетку попадает фаговая ДНК, то клетка переключается на репликацию ДНК фага.

Клетки заражали фагом Т4, давали импульсную метку Н3-тимидин и выращивали при двух температурах: 20С и 43С. Потом проводили центрифугирование в щелочном градиенте сахарозы.

Лигаза E. coli нуждается в коферменте НАД, а лигаза фага - в АТФ. Если E.coli не давать никотиновую кислоту (предшественник НАД), бактериальная ДНК реплицируется, но не сшивается.

Прерывистость репликации показана для всех объектов, кроме фагов, содержащих одноцепочечную ДНК.


У некоторых фагов и вирусов прерывистый синтез идет по обеим цепям. У бактерий и высших организмов одна цепь образуется непрерывно, а другая - прерывисто (лидирующая и запаздывающая цепи).

Размер фрагментов Оказаки видоспецифичен и составляет для фагов 1000-2000 нукл., E. сoli - 1000 нукл., для эукариот - 200-400 нукл.

У фага Т7 обе цепи ДНК тоже реплицируются прерывисто. Они имеют разную плотность одной больше пуринов). Цепи были разделены в градиенте плотности CsCl и помещены на две колонки. Была осуществлена ковалентная привязка, поэтому они не могли сойти со смолы. Потом провели репликацию в условиях импульсного мечения. Пропустили все фрагменты через первую колонку. Выход был 50%. Остальные прогнали через вторую колонку. Выхода не было. Таким образом, было показано, что фрагменты комплементарны обеим матричным цепям. Значит, фрагменты образуются по обеим цепям


Схема размножения фага М13

1974 г. Оказаки.


Рифампицин - ингибитор бактериальной РНК-полимеразы (на стадии инициации).

Хлорамфеникол - ингибитор трансляции на бактериальных рибосомах.

Если одновременно с заражением E. сoli фагом добавить хлорамфеникол, то блокируются трансляция, репликация II и сборка фагов.

Если подействовать рифампицином, то блокируется не только транскрипция и все следующие процессы, но и репликация I.

Вывод: бактериальная РНК-полимераза участвует в репликации ДНК фага.

Вся фаговая ДНК составляет ~6000 нукл.

Определение: origin (ori) - район начала репликации.

В районе ori (начало репликации) имеется 4 шпильки. Эти шпильки опознаются РНК-полимеразой, и вторая шпилька используется в качестве матрицы. По мере образования РНК шпилька плавится. Образуется РНК-затравка длиной 24 нукл., 3'-конец которой используется ДНК полимеразой III.


Когда 3'-конец синтезируемой цепи ДНК "утыкается" в 5'-конец РНК-затравки, ДНК-полимераза III вытесняется ДНК-полимеразой I, которая, обладая 5'3' гидролитической активностью, "съедает" РНК-затравку, одновременно продолжая синтез ДНК. Когда затравка (РНК) съедена, ДНК-полимераза I вытесняется лигазой, которая сшивает концы ДНК.

Все эти ферменты (ДНК-полимераза III, ДНК-полимераза I, лигаза) входят в состав реплисомы. Они представляют единый белковый комплекс, который реагирует изменением конформации на выполнение очередной функции.

Протяженная (более 100 нукл.) одноцепочечная ДНК-матрица может быть использована ДНК полимеразой III, когда полимераза III представлена в форме holo-фермента. Помимо субъединицы , обладающей полимеразной активностью, в holo-фермент входит еще несколько субъединиц, обеспечивающих высокую процессивность синтеза ДНК.

Фаг X174

Репликация ДНК этого фага не зависит от рифампицина.

Здесь работает не обычная РНК-полимераза, а особый фермент - праймаза. Он умеет делать только РНК-затравку.

Праймаза нуждается в дополнительных факторах - белках препрайминга. Точно так же помощью праймазы и белков препрайминга) образуются РНК-затравки при репликации ДНК E. сoli.

Праймосома - это белки препрайминга и праймаза.

Белки движутся по матричной цепи ДНК в 5' 3' направлении, праймаза - в противоположном, синтезируя РНК-затравки в организованных с помощью белков препрайминга участках ДНК на расстоянии ~1000 нукл. друг от друга.


Топологические проблемы репликации ДНК

SSB

Белки Альбертса, обнаруженные в 1968г., снижают температуру плавления ДНК in vitro на 20-40С. Они связываются с ДНК электростатически, хотя имеют отрицательный заряд. Эти белки содержат кластер положительно заряженных аминокислотных остатков, но общий заряд белка отрицателен.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

Похожие:

Определение предмета молекулярная биология iconМетодические указания к самостоятельной работе студентов По дисциплине: Молекулярная биология для специальностей 020201. 65 «Биология»
Методические указания предназначены для студентов биологического факультета очной формы обучения для изучения дисциплины «Молекулярная...
Определение предмета молекулярная биология iconП о биологии рассчитана на учащихся 10-11 классов
Биологические знания становятся с каждым годом более востребованными в нашем обществе. Открытия последних лет, совершенные в таких...
Определение предмета молекулярная биология iconПрограмма итогового государственного экзамена по специальности 010700/06 18 "Молекулярная биофизика"
Структурная организация биологических макромолекул. Курсы лекций: Биохимия. Молекулярная биология.(Воробьев), Молекулярная биофизика....
Определение предмета молекулярная биология iconКарманный формат для биологов в издательстве «Дрофа» вышел в свет очередной словарь терминов по биологическим наукам – «Биохимия и молекулярная биология»
Коничев А. С. Биохимия и молекулярная биология: словарь терминов / А. С. Коничев, Г. А. Севастьянова. – М.: Дрофа, 2008. – 359, [9...
Определение предмета молекулярная биология iconРабочая программа по курсу «биохимия и молекулярная биология»
Требования Государственного стандарта высшего обрвзования по специальности «Биология»
Определение предмета молекулярная биология iconПояснительная записка рабочая программа учебного предмета «Биология»
«Биология» для 9 -го класса. Рабочая программа составлена на основе примерной программы основного общего образования по биологии...
Определение предмета молекулярная биология iconРешение генетических задач
Ы «Генетика» и «Молекулярная биология» являются одними из самых сложных для понимания в школьном курсе общая биология. Облегчению...
Определение предмета молекулярная биология iconРешение генетических задач в старших классах
Ы: «Генетика» «Молекулярная биология» являются одними из самых сложных для понимания в школьном курсе общая биология. Облегчению...
Определение предмета молекулярная биология iconРешение генетических задач в старших классах
Ы: «Генетика» «Молекулярная биология» являются одними из самых сложных для понимания в школьном курсе общая биология. Облегчению...
Определение предмета молекулярная биология iconЛитература для подготовки к олимпиаде
Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж и др. Молекулярная биология клетки. Т. 1 М.: Мир, 1994
Разместите кнопку на своём сайте:
Библиотека


База данных защищена авторским правом ©lib.znate.ru 2014
обратиться к администрации
Библиотека
Главная страница