General introduction




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THESE


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DOCTEUR DE L’UNIVERSITE JOSEPH FOURIER-GRENOBLE I


Mention Biologie


Présentée par


Ying Yang


FACTEURS IMPLIQUES DANS LA DIFFERENCIATION ET LA TRANSDIFFERENCIATION DE L’EPITHELIUM CORNEEN


FACTORS INVOLVED IN CORNEAL EPITHELIUM DIFFERENTIATION AND TRANSDIFFERENTIATION


Soutenance prévue le 25 février 2005


Composition du jury :


Président : Pr. Stefan Nonchev

Rapporteurs : Dr. Colin A. Jahoda

Dr. Bernard Coulomb


Examinateurs : Dr. David J. Pearton

Pr. Michel. Mouillon

Pr. Danielle Dhouailly


Thèse préparée au sein de l’Equipe de Biologie de la Différenciation Epithéliale

Laboratoire d’Etude de la Différenciation et de l’Adhérence Cellulaire

CNRS-UMR 5538


Institut Albert Bonniot d’Ontologie et d’Oncogenèse,

Université Joseph Fourier-Grenoble I

SOMMAIRE--TABLE OF CONTENTS


RESUME …………………………………..…….……………………………. 5

SITUATION DU SUJET ET PRESENTATION DE LA THESE ………….7

GENERAL INTRODUCTION………………………………..………...........10



1. The adult cornea ………………… …………………………..……………10

1. 1 Structure ………………………………… …….………………..…………10

1. 2 Corneal stem cells ……………………………….………………..…….…...13


2. Development and structure of other head epithelia ……………….……19


2.1 Epidermis ……………………………………….…………………..…….19

2. 1-1 Introduction …………………………………….…………………..……19


2. 1-2 Role of the dermis in adult epidermal differentiation ……….…………………..……20


2. 1-3 Role of the dermis in embryonic epidermal differentiation ….…………………..……22


2. 1-4 Role of the dermal papilla in inducing hair in an adult epidermis …………………..……24


2. 1-5 Hair follicle and epidermal adult stem cells …………….………………..………25


2. 1-6 Main differences between corneal epithelium and epidermis ….…………………..……26


2. 2 Conjunctival epithelia …………………………….…………………..……27


2. 3 Oral epithelia …………………………………….……...…………...……28


2. 4 Nasal epithelia …………………………………….…………………..…29


3. Eye development and corneal epithelium differentiation …………..…29


3. 1 Dynamic of eye development …………………………….……………….....…29

3. 2 Cornea differentiation ……..………………………….…………………..…31


3. 3 Corneal epithelium differentiation and functions ……….………..…………..…34


3. 4 Tissues interactions and cornea transdifferentiation…………………………..…37


4. Pax6 gene ………….……………………………….…………………..…39


4. 1 Introduction ……….……………………………….…………………..… 39


4. 2 Targets of Pax6 in eye development ………………….…...……………….…42


4. 2-1 Pax6 and transcription factors ………….………………….…………………. 42

4. 2-2 Pax6 and crystallins ……………...…….………………….……...…………43


4. 2-3 Pax6 and keratins ……………...…….………………….………...……… 44

4. 3 Functions of Pax6 during eye development …..…………….………………… 45


4. 4 Developmental functions of Pax6 in other sites .…………….……………...… 47


BUTS DE LA THESE……..........................…….………………….…………49


AIMS OF THE THESIS……...…….………………….………...…………....52


RESULTATS ……..........................…….………………….…………….........55


RESULTS ………..........................…….………………….……………...…...58


I. Head expression pattern of Pax6 and K12 ……………...………………...58


I. 1 Introduction …..........................…….………………...….…………….… 58


I. 2 Materials and methods .................…….………………...….…………….… 58


I. 3 Results: Chick ..........................…….………………...….……………..… 59


I. 4 Results: Rabbit ..........................…….………………...….……………..…60


I. 5 Results: Human ..........................…….………………...….………………..61


I. 6 Conclusion …..........................…….…….…………...….………………..62


II. Ectopic expression of Pax6 in the head ….…………...….……………....63


II. 1 Introduction…..........................…….…….…………....….……………..…63


II. 2 Materials and methods ...............…….…….…………...….……….………63


II. 3 Results: Effects of Pax6 dominant positive cDNA expression ….……………….64


II. 4 Results: Effects of Pax6 dominant negative cDNA expression .….………….…...65


II. 5 Conclusion…..........................…….…….…………....….………………...66


III. The lens is not required either for corneal epithelium induction and

stroma migration .................…….…….…………....….…………………68

III. 1 Introduction ..........................…….…….…………....….…………….…..68


III. 2 Materials and methods ...........…….…….…………....….………………....68


III. 3 Results: Comparison of corneal development, in presence or absence of the lens….69

III. 4 Conclusion ........................…..….…….…………....….……………….. 70


IV. Differentiation abilities of corneal epithelium ….......….………………72


IV. 1. Recombinants of adult rabbit corneal epithelium and embryonic mouse dorsal

dermis …..........................…..….…….………….....….……………….72

IV. 1-1 Introduction ......................…...….…….………….....….………………72


IV. 1-2 Materials and methods ..........…...….…..….………….....….………………72


IV. 1-3 Results: Expression of Pax6 and K12 in the recombined corneal epithelium ……..………73


IV. 1.4 Conclusion .......................…..….…….………….....….……….……….74

IV. 2. Recombinants of chick corneal epithelium and chick dorsal dermis ….…...……74


IV. 2-1 Introduction .....................…....….…….………….....….…………….…75


IV. 2-2 Materials and methods .......…....….………..………….....….……………. 75


IV. 2-3 Results: The response of the chick corneal epithelium depends on the stage of embryonic

development ....................…....….…….………….....….…………….… 76

IV. 2-4 Conclusion ..................……....….…….………….....….……………….78


V. Can other epithelia be transdifferentiated into a corneal epithelium?…80


V. 1 Introduction ..............……....….…….………….....………..…………… 80

V. 2 Materials and methods ……....….…….………….....………..………….…80

V. 3 Results .............…………..….…….………….....………..………..……81

V. 3-1 Recombinants of chick embryonic dorsal epidermis and chick embryonic corneal stroma. ……81

V. 3-2 Recombinants of chick embryonic nasal epithelium and chick embryonic corneal stroma……..82

V. 3-3 Recombinants of chick embryonic oral epithelium and chick embryonic corneal stroma….…..82


V. 3-4 Recombinants of chick electroporated dorsal epidermis and chick embryonic corneal stroma…..83

V. 4 Conclusion .........…………..….…….………….....………..…………….83


CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES …...………………85


GENERAL CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES ……...……………..88


BIBLIOGRAPHY .......…………..….…….………….....………………...…92


SUMMARY.......…………..….…….………….....………………...verso cover page


RESUME


Plusieurs questions concernant les mécanismes de différenciation de l’épithélium cornéen ont été abordées: premièrement, le cristallin est-il réellement l’inducteur de la cornée? La kératine 12 (K12) est-elle spécifique de l’épithélium cornéen ou bien est-elle exprimée aussi dans d’autres épithélia? Enfin, quels sont les rôles respectifs du gène Pax6, le chef d’orchestre de la morphogenèse oculaire et des messages qui pourraient être transmis par le stroma cornéen?

Chez l’embryon de poulet de 2/3 jours, Pax6 est exprimé dans les noyaux non seulement des futurs tissus oculaires, mais aussi dans le cerveau, ainsi que dans l’épithélium nasal et oral. Après l’individualisation de la cornée, Pax6 continue d’être exprimé tout au long de la vie non seulement embryonnaire, mais aussi de la vie adulte. Par contre, l’expression de Pax6 est éteinte après 7 jours d’incubation dans l’épithélium nasal et oral.

L’expression de K12, marqueur de différenciation de l’épithélium est facilement observable seulement à partir d’un stade embryonnaire relativement avancé : 14 jours d’incubation pour le poulet, 21 jours de gestation pour le lapin, et tout au long de la vie adulte. Cette expression est spécifique de l’épithélium cornéen.

J’ai transfecté le cDNA codant pour une forme active de Pax6 (couplée à l’activateur VP16) chez l’embryon de poulet de 2.5 à 3 jours d’incubation, par la technique d’électroporation in ovo. Le résultat est une orientation dorso/ventrale anormale de l’œil, montrant l’importance d’une régulation fine et précise de la quantité et de la localisation de la protéine Pax6. Cependant aucune formation ectopique de tissus oculaires n’en a résulté.

J’ai étudié le rôle du cristallin, présenté comme l’inducteur de la cornée. Contrairement à ce qui a été publié antérieurement, celui-ci est seulement requis pour la croissance de l’œil mais ni pour la migration des fibroblastes formant le stroma de la cornée, ni pour l’expression de K12 dans son épithélium.

Afin d’étudier la question du rôle éventuel du stroma lors de l’activation des gènes Pax6, puis K12, j’ai réalisé plusieur types de recombinaisons épithélio/mésenchymateuses. Les recombinants ont été greffés sous la capsule du rein de souris athymique. Les expériences réalisées avec les tissus d’embryon de poulet montrent que Pax6 peut être éteint et le futur épithelium cornéen transformé en épiderme et en plumes seulement avant 5 jours d’incubation. En collaboration avec le Dr. David Pearton, nous avons montré que au contraire chez les mammifères, Pax6 peut être éteint et la formation d’un épiderme et de follicules pileux obtenus même à partir d’un épithélium cornéen prélevé chez l’adulte.

L’insuffisance du nombre de donneurs pour les greffes de cornée est un challenge. Nous nous sommes donc demandés si la transformation inverse de divers épithéliums en épithélium cornéen ètait réalisable. Ni l’association avec un stroma cornéen, ni la transfection de Pax6 n’a permis d’obtenir ce résultat.

Mots clé: poulet, cornée, interactions épithélio-mésenchymateuses, K12, cristallin, Pax6, lapin, transdifférenciation, peau.


SITUATION DU SUJET ET PRESENTATION DE LA THESE


Le développement de l’œil est un classique de l’embryologie. Au début du siecle dernier, Spemann (1901) avait le premier introduit la notion d’induction par des expériences restées célébres. Chez l’embryon d’amphibien, la greffe de la vésicule optique sous l’ectoderme de l’abdomen provoquait dans ce dernier la formation d’un cristallin. Ces expériences, qui ont déclanché toutes les recherches ultérieures en embryologie expérimentale, afin de déterminer les différentes interactions tissulaires responsables de la formation des divers organes…étaient entâchées d’erreur. Reproduites au début des années 90 à l’aide d’embryons donneurs marqués au FLDx elles montraient que dans les cas où un cristallin était obtenu, celui-ci était fluorescent, comme la vésicule optique. En fait la compétence de l’ectoderms à répondre à l’induction de la vésicule optique est restreinte à une partir de l’ectoderme céphalique (Grainger, 1992) et par une induction planaire issue de la plaque neurale.

En ce qui concerne la morphogénèse de la cornée, des expériences anciennes (review, Hay, 1980) d’excision de la vésicule cristallinienne chez l’embryon de poulet avaient conclu que cette dernière était responsable de l’induction de la cornée. Cette conclusion a depuis été reprise dans tous les livres d’enseignement de Biologie du Développement. Le groupe d’Overbeek à Houston a montré recemment que le cristallin est producteur de FGF10 (Govindarajan et al., 2000). Nous nous sommes alors demandé sile cristallin n’était pas simplement nécessaire à la croissance du globe optique. Nous disposions d’un anticorps monoclonal spécifique de la différenciation de l’épithélium cornéen pour analyser nos résultats.

La cornée est un organe épithélio-mésenchymateux. Elle est composée d’un épithélium pluristratié, non cornifié, qui provient de l’ectoderme embryonnaire et d’un tissu conjonctif à l’ordonnancement très règulier, le stroma. Au cours du développement elle se forme après que la vésicule cristallinienne se soit détachée de l’ectoderme, par la migration des cellules mésenchymateuses périoculaires, issues des crêtes neurales. Le mésenchyme cornéen jouait-il rôle dans la différenciation de l’épithélium cornéen? On sait que tel est le cas pour la majeure partie du tégument, i.e. la peau. Ceci a été démontré maintes fois, depuis les résultats classique obtenus par Dhouailly (1977).

Peau et cornée diffèrent par de nombreux caractères et en particulier par le type de kératines synthétisées. Les kératines, on en denombre plus de 30 principales (Moll et al., 1982), sont les filaments intermédiaires caractéritiques des cellules épithéliales. Elles se répartissent en deux grandes familles, les kératines dites acides, et le kératines dites basiques. Une kératine basique et une acide sont nécessaires à la formation d’hétérodimères qui se groupent ensuite en polymère constituant le filamant de kératine. Les travaux du laboratoire de Sun (1982) ont montré que les couches suprabasales de l’épiderme contiennent la paire de kératines K1, 2/K10, alors que toutes les couches de l’épithélium cornéen contiennent la paire de kératines K3/K12. Sun a avancé l’idée d’une paire de kératines specifiques de la différenciation d’un épithélium donné.

Des travaux récents (Nakamura et al., 2003) montrent qu’en fait K3 est aussi exprimé dans l’épithélium oral. L’expression de la partenaire K12 est-elle réellement restreinte à l’épithélium cornéen? Le gène de la kératine K12 a été montré comme directement régulé par le facteur de transcription Pax6 (Liu et al., 1999). Quel pourait être le rôle de Pax6 lors de la formation de la cornée? Pax6 a été montré par le laboratoire de Goehring à Bâle (1995) comme étant le gène chef d’orchestre (master gene) de la formation de l’œil. Son expression expérimentale dans les disques imaginaux d’antenne, de patte ou d’aile produit des Drosophiles "couvertes " d’yeux ectopiques. Des expériences réalisées durant la progression de mon travail de thèse ont donné des résultats similaires à ceux que j’ai obtenus: chez les oiseaux, l’expression ectopique de Pax6 n’est pas suffisante pour dèclencher la formation de structures oculaires dans l’etoderme de la tête.

Inversement, des expériences réalisées en collaboration avec David Pearton (Pearton, Yang and Dhouailly, PNAS, 2005, sous presse) ont montré que chez les mammifères, l’expression de Pax6 de l’épithélium cornéen est éteinte lorsque ce dernier est associé à un derme de peau embryonnaire et l’épithélium cornéen est ensuite transformé en épiderme. Le derme embryonnaire a-t-il une action inhibitrice sur l’expression de Pax6, ou bien le stroma cornéen a-t-il une formation activatrice? Les résultats de mes expériences réalisées chez le poulet montreront que la première proposition est en fait exacte. Pax6 étant exprimé à un stade embryonnaire jeune également dans l’épithélium nasal et oral (Tiffany et al., 2002). Nous nous sommes demandé si en associant ces deux types d’épithélium à un stroma cornéen ou pouvait obtenir leur transdifférenciation en épithélium cornéen. Au cours de mes travaux de thèse, le résultat d’expériences semblables aux miennes ont defrayé les médias : Une èquipe japonaise (Nakamura et al., 2003) ayanl affirmé avoir obtenu la transdifférenciation d’épithélium oral en épithélium cornéen. Hors ceci a une grande importance en chirurgie réparatrice humaine. Malheureusement mes propres résultats, obtenus chez le poulet, puis chez les mammifères montrent au contraire l’indépendance des épithéliums nasal, oral et épidermique, qui se différencient selon leur origine et ne sont pas influencés par leur association avec le stroma cornéen.

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